同时检测蔬菜和水果中7种杀软体动物剂的LC-MS/MS测定方法

摘要

本发明公开了一种同时检测蔬菜和水果中7种杀软体动物剂的LC-MS/MS测定方法，属于分析检测技术领域。所述的7种杀软体动物剂为杀螺胺、杀虫环、蜗螺杀、烟酰苯胺、五氯酚钠、灭梭威、四聚乙醛；本发明测定方法采用乙腈盐析萃取，PSA粉和C18粉净化，液相色谱-串联质谱进行蔬菜和水果中7种杀软体动物剂的同时定量测定。该方法操作简单，净化效果好，灵敏度高，重现性好，可广泛应用于蔬菜和水果中杀螺胺、杀虫环、蜗螺杀、烟酰苯胺、五氯酚钠、灭梭威、四聚乙醛7种杀软体动物剂的残留检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种同时检测果蔬中多种农药残留的方法，具体涉及一种可同时对蔬菜和水 果中7种杀软体动物剂进行定量测定的LC-MS/MS方法。

背景技术

防治蜗牛、田螺、钉螺等有害软体动物的农药叫做杀软体动物剂。由于硫酸铜和砷酸钙 等无机杀软体动物剂已停用，有机杀软体动物剂为目前化学防治软体动物的主要手段。有机 杀软体动物剂按化学结构分为下列几类：①酚类：如五氯酚钠、杀螺胺；②吗啉类：如蜗螺 杀；③有机锡类；④沙蚕毒素类：如杀虫环(杀虫丁)；⑤其它：如四聚乙醛、灭梭威、烟酰 苯胺。其中，五氯酚钠、蜗螺杀由于毒性极大，污染环境，已被禁用。杀螺胺、杀虫环、灭 梭威、四聚乙醛等虽然毒性中等或较低，但其广泛使用亦导致人畜中毒的事例时有发生，已 公开期刊文章“陆慧宁，任三香，祝亚非，等.有毒汤样中微量农药杀虫环的鉴定[J].分析 测试学报，2002，21(3):78-89”公开了一种可以鉴定杀虫环的方法，但是仅仅可以定性测定， 并不能达到定量检测的目的。同时，此类药物可在农作物、环境及水生生物中大量残留，最 终威胁人类健康。我国GB2763-2012规定了叶菜中的四聚乙醛残留限量是1.0mg/kg；糙米中 的四聚乙醛残留限量是0.2mg/kg；大米中的杀虫环为0.2mg/kg。杀虫环在日本肯定列表中限 量为0.050mg/kg。日本对灭梭威在红小豆、绿豆中限量为0.050mg/kg。

目前，关于杀软体动物剂残留量检测的研究较少。日本公布了灭梭威的液相色谱(HPLC) 检测方法(JAP-073)。国内有用气相色谱法(GC-ECD)检测杀虫环的报道；有用LC-MS/MS 检测灭梭威的报道，是针对河豚鱼、鳗鱼和对虾等高蛋白基质水产品的；用气相色谱法和 LC-MS/MS法检测四聚乙醛的报道，只针对蔬菜基质，且前处理方法较繁琐耗时，成本高； “四聚乙醛在烟草和土壤中的残留量检测与消解动态”公开了检测烟草和土壤中四聚乙醛的 测定方法，但上述方法检测种类比较单一，只涉及一种或两种杀软体动物剂，或前处理方法 尚需进一步完善；本作者曾建立了LC-MS/MS检测杀虫环、四聚乙醛、灭梭威的方法，该方 法检测目标物只涉及三种杀软体动物剂，且前处理方法尚需进一步完善。因此，建立一种快 速、灵敏、准确的杀螺胺、杀虫环、蜗螺杀、烟酰苯胺、五氯酚钠、灭梭威、四聚乙醛7种杀 软体动物剂同时检测方法变得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种蔬菜和水果中7种杀软体动物剂的同时 定量测定方法。

本发明建立的液质串联检测方法采用一次色谱过程分析蔬菜和水果中的7种杀软体动物 剂残留量，包括杀螺胺、杀虫环、蜗螺杀、烟酰苯胺、五氯酚钠、灭梭威、四聚乙醛。

本发明所采用的技术方案为：

同时检测蔬菜和水果中7种杀软体动物剂的LC-MS/MS测定方法，其特征是，

所述的7种杀软体动物剂为杀螺胺、杀虫环、蜗螺杀、烟酰苯胺、五氯酚钠、灭梭威、 四聚乙醛；

具体包括以下步骤：

(1)提取：取果蔬样品，置于离心管中，加入乙腈，在匀浆机中高速匀浆1min，再加 入2.0-5.0g氯化钠于离心管中，再次匀浆，将离心管置于离心机中，离心，吸取上清液置于 离心管中，然后将离心管置于40℃水浴中氮气吹近干，加入乙腈溶解残渣涡流，得待净化溶 液；

(2)净化：向步骤(1)制得的待净化溶液中加入0.05-0.30g PSA粉和0.05-0.30g C18 粉于离心管中，涡流，离心，取上清液，置于另一离心管中氮气吹近干，用甲醇定容，涡流 混合后过0.22μm滤膜，即得待测样品；

(3)检测：待步骤(2)得到的测样品用液相色谱-串联四级杆质谱进行测定。

优选的，具体包括以下步骤：

(1)提取：称取10.00g果蔬样品，置于50mL离心管中，准确加入20mL乙腈，在匀浆 机中高速匀浆1min，再加入2.0-5.0g氯化钠于离心管中，再次匀浆1min，将离心管置于离心 机中，3000r/min离心5min，吸取上清液10mL于10mL离心管中，置于40℃水浴中氮气吹 近干，准确加入2.0mL乙腈溶解残渣涡流2min待净化，得待净化溶液；

(2)净化：向步骤(1)制得的待净化溶液中加入0.05-0.30g PSA粉和0.05-0.30g C18 粉于离心管中，涡流2min，离心，取1.0mL上清液，置于另一10mL离心管中氮气吹近干， 用甲醇定容至1.0mL，涡流混合后过0.22μm滤膜，即得待测样品；

(3)检测：待步骤(2)得到的测样品用液相色谱-串联四级杆质谱进行测定。

优选的，所述步骤(3)中液相色谱-串联四级杆质谱的仪器参数条件如下：

液相色谱条件为：

质谱条件为：

选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量为：

本发明的有益效果：

本发明对蔬菜和水果中7种杀软体动物剂的残留检测进行了研究，果蔬样品经乙腈盐析 萃取，PSA粉和C18粉净化，采用LC-MS/MS定量测定。该方法操作简单，灵敏度高，重 现性好，准确率较高(回收率高，有些回收率偏低的是由于该种物质本身不稳定，易分解。 并且7种物质是无相互关联的，且非同系物)。可广泛应用于蔬菜和水果中杀螺胺、杀虫环、 蜗螺杀、烟酰苯胺、五氯酚钠、灭梭威、四聚乙醛7种杀软体动物剂的残留检测。

本发明在检测步骤之前对样品提取液进行净化处理，可有效地除去干扰物，方法灵敏度、 准确度和精确度均符合农药残留分析标准，具有一定的新颖性和适用性。

本发明的方法中，7种杀软体动物剂同时进行提取、净化等前处理(本发明的7种物质 为非同系物，由于不同物质的性质不同，在提取的过程中，很难把所有目标物都提取完全， 但是，本发明的方法，同时提取、净化，并且7种目标物提取比较完全，实施例中的回收率 就可以说明这点)，并且一次上机检测，节约时间和成本。

附图说明

图1 为甲醇+0.1％甲酸水溶液7种杀软体动物剂MRM色谱图；

图2 7种杀软体动物剂农药混合标准溶液的MRM总离子流及特征离子对色谱图。其中： 1-杀虫环、2-四聚甲醛、3-烟酰苯胺、4-灭梭威、5-杀螺胺、6-五氯酚钠、7-蜗螺杀；

图3 白菜样品中7种杀软体动物剂的MRM及特征离子对色谱图；

图4 白菜加标样品中7种杀软体动物剂的MRM及特征离子对色谱图；

图5 是实施例1的分析色谱图；

图6 是实施例2的分析色谱图；

图7 是实施例3的分析色谱图；

图8 是实施例4的分析色谱图。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不 仅仅局限于下面的实施例，实施例不应视作对本发明保护范围的限定。

1仪器与试剂

液相色谱串联质谱仪：Aglient1200高效液相色谱仪，API4000质谱仪(美国AB SCIEX)； MS3涡流混匀器(IKA公司)；感量为0.1mg的分析天平(瑞士梅特勒公司)；Milli-Q纯水器 (美国Millipore公司)；IKA-GM200型高速均质器(德国IKA公司)；N-EVAP24氮吹仪(美 国)；量程为10-100μL、100-1000μL移液枪(Eppendof公司)。

四聚乙醛、灭梭威、杀虫环、五氯酚钠、蜗螺杀、杀螺胺、烟酰苯胺标准品(Dr Ehrenstorfer 公司)；甲醇：色谱纯(Merk公司)；乙腈：色谱纯(Merk公司)；丙酮：色谱纯(Merk公司)；乙 酸乙酯：色谱纯(Merk公司)；甲酸：分析纯；氯化钠：分析纯；C18粉末：Agela Technologies 公司；乙二胺-N-丙级硅烷(PSA)粉末：Agela Technologies公司；氨丙基(NH₂)粉末： Agela Technologies公司；石墨碳黑(PestiCarb)粉末：Agela Technologies公司；氧化铝粉 末：Agela Technologies公司；弗罗里硅土粉末：Agela Technologies公司。

2标准溶液配制

分别称取四聚乙醛，灭梭威、杀虫环、五氯酚钠、蜗螺杀、杀螺胺、烟酰苯胺标准品各 10.0mg，用甲醇溶解后，并分别定容于100mL棕色容量瓶中，即得100mg/L标准储备液。棕色 瓶储存于-18℃备用。

取空白样品按上述提取和净化方法进行处理，得到空白基质提取净化液。用该基质溶液 稀释标准储备制成系列标准工作溶液，进行LC-MS/MS分析。以标准工作液的浓度为横坐标， 峰面积为纵坐标，绘制相关线性方程。

3样品提取与净化

3.1提取

称取10.00g(精确到0.01g)蔬菜或水果样品，置于50mL离心管中，准确加入20mL乙 腈，在匀浆机中高速匀浆1min，再加入2.0-5.0g氯化钠于离心管中，再次匀浆1min，将离心 管置于离心机中，3000r/min离心5min，吸取上清液10mL于10mL离心管中，置于40℃水 浴中氮气吹近干。准确加入2.0mL乙腈溶解残渣涡流2min待净化。

3.2净化

向上述制得的待净化溶液中加入0.05-0.30g PSA粉和0.05-0.30g C18粉于离心管中，涡 流2min，离心，取1.0mL上清液，置于另一10mL离心管中氮气吹近干，用甲醇定容至1.0mL， 涡流混合后过0.22μm滤膜，进行LC-MS/MS分析。

4检测

待测样品用液相色谱-串联四级杆质谱进行测定，仪器参数条件见下表1，选择反应监测 母离子、子离子和碰撞能量见表2。

表1液相色谱-串联四级杆质谱的仪器参数条件

表2 7种杀软体动物剂的LC-MS/MS分析参数

名称 保留时间(min) 母离子 子离子 锥孔电压(v) 杀虫环 2.06 181.9 137.0^*,73.0 40 四聚乙醛 3.57 194.1 62.0^*,89.0 35 烟酰苯胺 6.44 199.1 80.0^*,154.0 75 灭梭威 13.27 226.1 169.1^*,121.1 50 五氯酚钠 16.65 264.7 37.2^*,35.2 -75 杀螺胺 17.95 326.8 173.0^*,291.0 -80 蜗螺杀 19.96 243.2 165.1^*,228.1 50

5.结果与讨论

5.1色谱质谱条件的优化

5.1.1流动相的选择

比较了乙腈+0.1％甲酸水溶液，甲醇+5mmol/L乙酸铵水溶液，甲醇+0.1％甲酸水溶液不 同流动相对色谱图的影响。结果表明，以甲醇+0.1％甲酸水溶液为流动相，采用梯度洗脱，7 种杀软体动物剂的能够快速分离，且每种化合物色谱峰对称尖锐，分离效果较好，MRM色 谱图如附图1所示。

5.1.2质谱测定条件的优化

首先分别采用浓度为500μg/L的标准溶液以蠕动泵连续进样的方式进行母离子全扫描， 确定每种农药的母离子质量数，然后再以母离子进行2级碰撞扫描，选择两个丰度比较高的 子离子作为定性和定量离子。同时优化质谱条件，确定质谱最佳条件，建立多离子反应监测 模式。图2为7种杀软体动物剂农药混合标准溶液的MRM总离子流及特征离子对色谱图。

5.2提取条件的优化

由于溶解性和极性相差较大，选择提取溶剂要保证农药在提取溶剂中有足够的可溶性和 稳定性，在此基础上尽量减少其它分子和干扰成分的提取。本实验比较了乙腈、乙酸乙酯、 丙酮作为提取溶剂，发现乙腈提取效率较高，共萃取的杂质较少。采用乙腈为提取剂，同时 利用盐析效应除去水分及可溶于水的干扰物。

5.3净化条件的优化

净化剂在除杂质的同时也可能对目标化合物产生吸附。首先将2mL0.10μg/mL7种农药混 合标准溶液分别经100mg PSA粉、C18粉、氧化铝粉、弗罗里硅土粉、氨丙级(NH₂)粉和 20mg CARB粉涡旋净化，处理后上机发现氧化铝粉和石墨碳黑(CARB)粉吸附厉害，回收 差，其余四种对7种农药几乎无吸附。

净化剂的另一目的是去除杂质效果好。分别向2mL韭菜浓缩液中100mg PSA粉、C18 粉、弗罗里硅土粉、氨丙级(NH₂)粉。处理后上机发现弗罗里硅土粉、氨丙级粉净化效果 差，最终选择100mg C18粉和100mg PSA粉对样品进行处理净化。

5.4基质效应的优化

电喷雾离子源(ESI)易受样品基质的影响。为消除样品基质效应，应以空白样品提取液 作为标准溶液的稀释液来消除样品基质效应。

5.5方法的线性和检出限

将空白样品按上述提取和净化过程进行处理，得到空白基质提取净化液。用该基质溶液 将标准液稀释成10μg/L，20μg/L，40μg/L，80μg/L，100μg/L，200μg/L，400μg/L，800μg/L， 1000μg/L标准工作液，LC/MS/MS进行分析后，以目标组分的峰面积y对相应的质量浓度x (μg/L)，绘制标准曲线，见表3。结果表明五氯酚钠、杀虫环在100-1000μg/L线性范围内具 有良好的线性关系；四聚甲醛、灭梭威、烟酰苯胺、蜗螺杀、杀螺胺在10-1000μg/L线性范 围内具有良好的线性关系，相关系数在0.9949-0.9994之间。

根据空白样品的3倍信噪比确定方法的检出限，10倍信噪比确定方法的定量限。蔬菜和 水果中7种杀软体动物剂汇总至表3。

表3 7种农药的线性方程、线性范围、相关系数和方法定量限

组分 线性方程 相关系数(r²) 线性范围(μg/L) 定量限(μg/kg) 四聚乙醛 y＝59.7x+3.81e³0.9964 10-1000 10 杀虫环 y＝1.34e⁴x+7.31e⁵0.9961 100-1000 10 灭梭威 y＝1.65e⁴x+3.84e⁵0.9949 10-1000 5 五氯酚钠 y＝5.52e³x+4.04e⁴0.9975 100-1000 10 烟酰苯胺 y＝5.0e³x+3.77e⁴0.9994 10-1000 10 蜗螺杀 y＝5.82e³x+4.84e⁴0.9994 10-1000 10 杀螺胺 y＝2.52e⁴x+1.27e⁵0.9981 10-1000 5

5.6回收率和精密度

对蔬菜和水果样品进行添加回收实验，按上述前处理的方法提取、净化、上机，每个浓 度做平行实验6次，测得回收率在80.6％-104％之间，相对偏差均小于8.0％，实验结果见表4： 其中四聚乙醛回收率在80.6％-93.0％之间，回收率普遍较低是因为此化合物受热或遇酸易分 解。

表4样品中7种杀软体动物剂残留量回收率和精密度实验结果

5.7方法的应用

白菜样品，及加入四聚乙醛，灭梭威、杀虫环、五氯酚钠、蜗螺杀、杀螺胺、烟酰苯胺 标准溶液的样品，按“3样品提取与净化”的实验步骤操作完毕后上机，测得色谱图如图3和图 4所示：

从色谱图中可以看出，白菜样品基质不干扰7种杀软体动物剂的测定，加标样品回收较 好。

实验表明，采用本法可同时检测蔬菜和水果中7种杀软体动物剂，简便快速，准确灵敏、 重现性好，完全满足进出口食品农产品的产品质量控制要求。

实施例1：

白菜样品中7种杀软体动物剂的测定。

3样品提取与净化

3.1提取

分别称取10.00g(精确到0.01g)空白白菜样品置于50mL离心管中，分别在离心管中添 加三个不同浓度(10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg)的四聚乙醛，灭梭威、杀虫环、五氯酚钠、 蜗螺杀、杀螺胺、烟酰苯胺标准溶液，每个浓度水平设置6个平行，准确加入20mL乙腈， 在匀浆机中以10000r/min匀浆1min，再加入3.0g氯化钠于离心管中，再次匀浆1min，将离 心管置于离心机中，3000r/min离心5min，吸取上清液10mL于10mL离心管中，置于40℃ 水浴中氮气吹近干。准确加入2.0mL乙腈溶解残渣涡流2min待净化。

3.2净化

向上述制得的待净化溶液中加入0.10gPSA粉和0.10gC18粉于离心管中。涡流2min，离 心。取1.0mL上清液，置于另一10mL离心管中氮气吹近干，用甲醇定容至1.0mL，涡流混 合后过0.22μm滤膜，进行LC-MS/MS分析。

4检测

待测样品用液相色谱-串联四级杆质谱进行测定，仪器参数条件见表5，选择反应监测母 离子、子离子和碰撞能量见表6；

表5液相色谱-串联四级杆质谱的仪器参数条件

表6 7种杀软体动物剂的LC-MS/MS分析参数

名称 保留时间(min) 母离子 子离子 锥孔电压(v) 杀虫环 2.06 181.9 137.0^*,73.0 40 四聚乙醛 3.57 194.1 62.0^*,89.0 35 烟酰苯胺 6.44 199.1 80.0^*,154.0 75 灭梭威 13.27 226.1 169.1^*,121.1 50 五氯酚钠 16.65 264.7 37.2^*,35.2 -75 杀螺胺 17.95 326.8 173.0^*,291.0 -80 蜗螺杀 19.96 243.2 165.1^*,228.1 50

该样品回收率和精密度实验结果见表7。

表7白菜中7种杀软体动物剂残留量回收率和精密度实验结果

实施例2

草莓样品中7种杀软体动物剂的测定。

3样品提取与净化

3.1提取

分别称取10.00g(精确到0.01g)空白草莓样品置于50mL离心管中，分别在离心管中添 加三个不同浓度(10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg)的四聚乙醛，灭梭威、杀虫环、五氯酚钠、 蜗螺杀、杀螺胺、烟酰苯胺标准溶液，每个浓度水平设置6个平行，准确加入20mL乙腈， 在匀浆机中以10000r/min匀浆1min，再加入3.5g氯化钠于离心管中，再次匀浆1min，将离 心管置于离心机中，3000r/min离心5min，吸取上清液10mL于10mL离心管中，置于40℃ 水浴中氮气吹近干。准确加入2.0mL乙腈溶解残渣涡流2min待净化。

3.2净化

向上述制得的待净化溶液中加入0.15gPSA粉和0.15gC18粉于离心管中。涡流2min，离 心。取1.0mL上清液，置于另一10mL离心管中氮气吹近干，用甲醇定容至1.0mL，涡流混 合后过0.22μm滤膜，进行LC-MS/MS分析。

4检测

该样品回收率和精密度实验结果见表8。

表8草莓中7种杀软体动物剂残留量回收率和精密度实验结果

实施例3

菠菜样品中7种杀软体动物剂的测定。

3样品提取与净化

3.1提取

分别称取10.00g(精确到0.01g)空白菠菜样品置于50mL离心管中，分别在离心管中添 加三个不同浓度(10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg)的四聚乙醛，灭梭威、杀虫环、五氯酚钠、 蜗螺杀、杀螺胺、烟酰苯胺标准溶液，每个浓度水平设置6个平行，准确加入20mL乙腈， 在匀浆机中以10000r/min匀浆1min，再加入3.0g氯化钠于离心管中，再次匀浆1min，将离 心管置于离心机中，3000r/min离心5min，吸取上清液10mL于10mL离心管中，置于40℃ 水浴中氮气吹近干。准确加入2.0mL乙腈溶解残渣涡流2min待净化。

3.2净化

向上述制得的待净化溶液中加入0.15gPSA粉和0.15gC18粉于离心管中。涡流2min，离 心。取1.0mL上清液，置于另一10mL离心管中氮气吹近干，用甲醇定容至1.0mL，涡流混 合后过0.22μm滤膜，进行LC-MS/MS分析。

4检测

该样品回收率和精密度实验结果见表9。

表9菠菜中7种杀软体动物剂残留量回收率和精密度实验结果

实施例4

白瓜样品中7种杀软体动物剂的测定。

3样品提取与净化

3.1提取

分别称取10.00g(精确到0.01g)空白白瓜样品置于50mL离心管中，分别在离心管中添 加三个不同浓度(10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg)的四聚乙醛，灭梭威、杀虫环、五氯酚钠、 蜗螺杀、杀螺胺、烟酰苯胺标准溶液，每个浓度水平设置6个平行，准确加入20mL乙腈， 在匀浆机中以10000r/min匀浆1min，再加入3.0g氯化钠于离心管中，再次匀浆1min，将离 心管置于离心机中，3000r/min离心5min，吸取上清液10mL于10mL离心管中，置于40℃ 水浴中氮气吹近干。准确加入2.0mL乙腈溶解残渣涡流2min待净化。

3.2净化

向上述制得的待净化溶液中加入0.10gPSA粉和0.10g C18粉于离心管中。涡流2min，离 心。取1.0mL上清液，置于另一10mL离心管中氮气吹近干，用甲醇定容至1.0mL，涡流混 合后过0.22μm滤膜，进行LC-MS/MS分析。

4检测

该样品回收率和精密度实验结果见表10。

表10白瓜中7种杀软体动物剂残留量回收率和精密度实验结果