一种载玻片原位培养羊水细胞及核型处理分析的方法

摘要

本发明提供了一种载玻片原位培养羊水细胞及核型处理分析的方法，本发明在以前的研究基础上进一步提高，采用特定浓度和种类的低渗液、预固定液，严格控制染色体分散时分散环境的温度和湿度，以获得丰富的优质分裂相，此技术将为高通量自动扫描捕获体系提供了基础技术平台，建立自动化阅片流程，提升临床工作效率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种羊水细胞培养领域，具体涉及一种载玻片原位培养羊水细胞及核型处理分析的方法。

背景技术

羊水细胞培养及核型分析是产前诊断的关键技术，该技术需要历经羊水细胞贴壁、收获（低渗、预固定）、制片（染色体分散）、显微镜下拍取核型以及核型分析等诸多步骤，以完成最终的临床报告。随着产前筛查不断普及和产前诊断需求量急速增加的状况，传统的羊水细胞培养（耗时、耗力）无法满足临床需求，且传统的羊水细胞培养步骤繁多，制片质量不稳定，不宜于产前诊断质量控制。为了缩短培养时间，提高工作效率，研究人员成功研制自动核型扫描仪，即将显微镜与自动进片的轨道相连接，以实现24小时无人值守全自动换片、取片、扫描、滴油、采集核型。该仪器在外周血及FISH核型捕获中显示快速、省力的极好效果，但羊水原位培养的细胞贴壁于4×6cm²的塑料培养瓶，塑料瓶底片不平整、厚度太高，显微镜无法自动调节焦距自动扫描捕获。国外普遍采取盖玻片法，该法将细胞贴壁在盖玻片，以培养平皿为载体，收获细胞后移出盖玻片到载玻片上，再用胶粘附实现核型分析，但由于粘附剂关系，厚度不适合显微镜调节聚焦，或以反面自动阅片，效果局限。载玻片原位培养羊水细胞可以解决上述两种方法的不足。Tabor等使用NUNC公司的载玻片培养皿进行羊水细胞原位培养，但分析成本太高，国内不易普及。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种载玻片原位培养羊水细胞及核型处理分析的方法。

本发明采用的技术解决方案是：一种载玻片原位培养羊水细胞的方法，包括以下步骤：

（1）接种：将每个羊水细胞标本取18-22ml，无菌分入尖底离心管2管，9-11ml/管，平衡离心10min，转速为1200rpm，各管留取0.5ml细胞悬液，各加入1.5ml羊水培养基，充分混匀，平铺于载玻片的细胞贴壁面，在37℃，5％CO₂的条件下培育2天， 2天后在载玻片内再缓慢添加3ml羊水培养基，新添加的培养基与旧培养基混合均匀，重新置于37℃，5％CO₂的条件下培育5天；

（2）换液：待羊水细胞培养至7-8天，倒置于显微镜下观察生长进展，待克隆细胞群增殖，用2ml/瓶新鲜的羊水培养基替换旧培养基，待第二天即收获包含原位培养的羊水细胞载玻片。

所述的一种载玻片原位培养羊水细胞的方法，所述的步骤（1）中细胞悬液为羊水细胞沉淀和羊水。

一种羊水细胞核型处理分析的方法，包括以下步骤：

（1）收获、制片：在含原位培养的羊水细胞载玻片中加入秋水仙素，摇匀，再置入5％CO₂，37℃培养箱25min，弃去上清液；

（2）低渗：羊水细胞载玻片中缓慢加入预温37℃的低渗液6ml，室温平置25min；

（3）预固定：缓慢抽取载玻片的上清液，弃之，后缓慢加预固定液6ml，7min之后，弃上清液，再加入4ml新鲜固定液，冲洗细胞壁，弃上清液；

（4）固定：再在载玻片中加如新鲜固定液6ml，室温静置10min，弃上清液；

（5）重复第（4）步步骤2次，静置时间缩短为1min；

（6）用镊子取出载玻片，用纱布吸去多余的固定液，放入染色体分散仪器中，设定温度为21℃，湿度为30或33％，待载玻片完全干燥；

（7）将载玻片置于烘箱65℃下烤片2h，取出载玻片后，1mg/ml胰酶浸泡处理16-20s，Giemsa染液浸泡处理10min；

（8）拍取核型：采用显微镜拍取羊水细胞载玻片：，GLS-120自动核型扫描仪捕获采集染色体核型。

所述的一种羊水细胞核型处理分析的方法，其特征在于：所述的秋水仙素浓度为20ug/ml。

所述的一种羊水细胞核型处理分析的方法，其特征在于：所述的低渗液为浓度1%的枸橼酸钠。

所述的一种羊水细胞核型处理分析的方法，其特征在于：所述的预固定液为浓度5%的冰醋酸。

所述的一种羊水细胞核型处理分析的方法，其特征在于：所述的固定液为甲醇：冰乙酸＝3：1的卡诺固定液。

所述的一种羊水细胞核型处理分析的方法，其特征在于：所述的Giemsa染液成份为1：10的Giemsa原液与PH6.8的磷酸缓冲液。

本发明得到的有益效果是：本发明提供了一种载玻片原位培养羊水细胞及核型处理分析的方法，本发明在以前的研究基础上进一步提高，采用特定浓度和种类的低渗液、低渗时间、预固定液、预固定时间、固定液、固定时间以及严格控制染色体分散时分散环境的温度和湿度，以获得丰富的优质分裂相，此技术将为高通量自动扫描捕获体系提供了基础技术平台，建立自动化阅片流程，提升临床工作效率，本发明的有益效果主要体现在：（1）本发明不干扰产前诊断程序，不增加羊水穿刺次数及羊水量，不存在伦理问题；（2）本发明所涉及的试剂为自配试剂，原材料均可国内购买，无需额外增加试剂，不增加成本；（3）本发明建立的羊水原位培养方法可以用于自动显微镜扫描，解决了产前诊断自动化关键技术，且建立规范化流程，达到制片质量稳定，获得培养克隆丰富、分裂相优质，成功率高等特点；（4）本发明可采用国产载玻片，获得细胞克隆数和有效分裂相数能力不亚于进口载玻片，且国产载玻片价格低。

附图说明

图1为本发明的国产载玻片无菌培养盒。

图2:为本发明载玻片示意图。

图3为本发明羊水细胞生长图。

图4为染色体核型分散质量评估对照图。

其中图2中：a为载玻片标记处；b为载玻片细胞贴壁面。

具体实施方式：

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。

下面结合具体实施例对本技术进行进一步描述（本发明的试剂除特殊说明外，国产载玻片购自杭州宝荣公司；进口载玻片为意大利Euroclone；羊水培养基为以色列的BIOAMF-2培养基）：

实施例1：国产载玻片与进口载玻片同步培养羊水细胞

（1）接种：选取10个羊水标本，每个标本取18-22ml。无菌分入尖底离心管2管，9-11ml/管，平衡离心10min，转速为1200rpm，各管留取0.5ml细胞悬液（羊水细胞沉淀+少许羊水），各加入1.5ml羊水培养基，分别平铺于国产载玻片、进口原装载玻片培养瓶的细胞贴壁面（图2b），在37℃，5％CO₂的条件下培育2天，最少的机械干扰，2天后在载玻片的标记处（图2a）再添加3ml羊水培养基，新添加的培养基与旧培养基混合均匀，重新置于37℃，5％CO₂的条件下培育5天。

（2） 换液：待羊水细胞培养至7-8天，倒置于显微镜下观察生长进展，待克隆细胞群增多，面积大，透亮细胞多时，用2ml/瓶新鲜的羊水培养基替换旧培养基，待第二天即收获包含原位培养的羊水细胞载玻片。原来的培养物传代到对应组织细胞培养瓶中，继续生长，待出报告后，弃之。

（3）收获、制片：在含原位培养的羊水细胞载玻片中加入秋水仙素，摇匀，再置入5％CO₂，37℃培养箱25min，弃去上清液；

（4）低渗：羊水细胞载玻片中的标记处（图2a）缓慢加入预温37℃的低渗液6ml，低渗液为浓度1%的枸橼酸钠，室温平置25min；

（5）预固定：在载玻片的标记处（图2a）缓慢抽取载玻片的上清液，弃之，后缓慢加预固定液6ml，预固定液为浓度5%的冰醋酸，7min之后，弃上清液，再加入4ml新鲜固定液，冲洗细胞壁，弃上清液；

（6）固定：再在载玻片中加如新鲜固定液6ml，固定液为甲醇：冰乙酸＝3：1的卡诺固定液，室温静置10min，弃上清液；

（7）重复固定步骤2次，静置时间缩短为1min；

（8）用镊子取出载玻片，玻片边缘靠在纱布上，吸去多余的固定液，放入染色体分散仪器中，设定温度为21℃，湿度为30或33％，待载玻片完全干燥；

（9）将载玻片置于烘箱65℃下烤片2h，取出载玻片后，1mg/ml胰酶浸泡处理16-20s，Giemsa染液浸泡处理10min，Giemsa染液成份为1：10的Giemsa原液与PH6.8的磷酸缓冲液；

（10）拍取核型：采用GLS-120自动扫描捕获体系捕获染色体核型。染色体分散质量采用数字评分：1)分散（不是所有染色体都在一个视野中）；2)优质（所有染色体都在一个视野中，且染色体交叉少于或等于5条）；3)差（染色体交叉大于5条）。

（11）临床报告：分析染色体核型，15个核型/人。

上述步骤中所用的秋水仙素浓度为20ug/ml。

3)计算载玻片上贴壁的细胞克隆数及优质分裂相。载玻片上细胞克隆成片生长，细胞计为60个。

如图3所示，图3：a：国产载玻片上细胞克隆生长；b：高倍镜（100倍放大）见大量中期分散的分裂相；c：见优质中期分裂相。

通过与进口载玻片同步培养比对，细胞克隆数P=0.128（P>0.05），优质分裂相数P=0.555（P>0.05）无统计学差异（表1），认为其获得细胞贴壁克隆以及有效分裂相能力不亚于进口载玻片，且国产的载玻片价格低廉。

实施例2：国产载玻片培养羊水收获过程中不同低渗液对分裂相的影响

1)接种：取24个羊水标本，每个标本取5ml，混均（消除标本间各体差异），分12瓶，每个条件2瓶。10ml/管，平衡离心10min，转速为1200rpm，各管留取0.5ml细胞悬液（羊水细胞沉淀+少许羊水），各加入1.5ml羊水培养基，分别平铺于国产载玻片、进口原装载玻片培养瓶的细胞贴壁面（图2b），在37℃，5％CO₂的条件下培育2天，最少的机械干扰2天后在载玻片的标记处（图2a）再添加3ml羊水培养基，新添加的培养基与旧培养基混合均匀，重新置于37℃，5％CO₂的条件下培育5天。

2) 换液：待羊水细胞培养至7-8天，倒置于显微镜下观察生长进展，待克隆细胞群增多，面积大，透亮细胞多时，用2ml/瓶新鲜的羊水培养基替换旧培养基，待第二天即收获包含原位培养的羊水细胞载玻片。

3)收获：秋水仙素终止分裂后，分别缓慢加入预温37℃的不同低渗液（具体种类见表2）各6ml，室温平置，25min，之后预固定、固定、分散（同实施例1）。

拍片（同实施例1）。

根据染色体分散质量选取优质分裂相，结果如下（表2）：

结果显示采用1%枸橼酸钠低渗液，每张载玻片所获得的优质分裂相较多。

实施例3：国产载玻片培养羊水收获过程中不同预固定液对分裂相的影响

1)接种：取20个羊水标本，每个标本取5ml，混均（消除标本间各体差异），分10瓶，每个条件2瓶。10ml/管，平衡离心10min，转速为1200rpm，各管留取0.5ml细胞悬液（羊水细胞沉淀+少许羊水），各加入1.5ml羊水培养基，分别平铺于国产载玻片、进口原装载玻片培养瓶的细胞贴壁面（图2b），在37℃，5％CO₂的条件下培育2天，最少的机械干扰，2天后在载玻片的标记处（图2a）再添加3ml羊水培养基，新添加的培养基与旧培养基混合均匀，重新置于37℃，5％CO₂的条件下培育5天。

2)换液（同实施例1）

3)收获：秋水仙素终止分裂后，1%枸橼酸钠低渗25min，缓慢加入不同预固定液及（具体见表3）7min之后，弃上清液，之后固定、分散（同实施例1）。

4)拍片（同实施例1）

根据染色体分散质量选取优质分裂相，结果如下（表3）：

结果显示采用5%冰乙酸预固定液，每张载玻片所获得的优质分裂相较多。

实施例4：染色体分散时分散环境的温度和湿度对分裂相的影响

1)接种：选取60个羊水标本，每个标本取5ml，混均（消除标本间各体差异），分30瓶，每个条件2瓶。10ml/管，平衡离心10min，转速为1200rpm，各管留取0.5ml细胞悬液（羊水细胞沉淀+少许羊水），各加入1.5ml羊水培养基，分别平铺于国产载玻片、进口原装载玻片培养瓶的细胞贴壁面（图2b），在37℃，5％CO₂的条件下培育2天，最少的机械干扰，2天后在载玻片的标记处（图2a）再添加3ml羊水培养基，新添加的培养基与旧培养基混合均匀，重新置于37℃，5％CO₂的条件下培育5天。

2)换液（同实施例1）

3)收获、制片： 收获后放入Optichrome染色体分散仪，选择不同的温度，湿度干燥。温度范围：19~21℃，间隔2℃；湿度范围：30~42％，间隔3％。

4)显微镜拍取核型：GLS-120采集核型图片，计算染色体核型分散完整度、染色体重叠数目、判断核型满意度（表4）。

备注：*15/40（38％）表示分析40个完整核型，其中15个核型的染色体分散质量被评定为“优”，占38％。

评判标准如图4所示，a:染色体核型分散质量评估为“优”；b：染色体核型分散质量评估为“分散”；c：染色体核型分散质量评估为“差”，染色体交叉数目>5。

选择较适温度、湿度组合的制片条件：T=21,H=30；T=21,H=33。可有>60％的优质中期分裂相用于染色体核型分析。

实施例5：国产载玻片与常规塑料瓶原位培养临床应用比对研究

1)接种：选取100例临床产前诊断羊水标本，每个标本取20ml。离心，各管留取0.5ml细胞悬液（细胞沉淀+少许羊水），充分混匀，其中一管加1.5ml羊水培养基，混匀，平铺于载玻片的细胞贴壁面（图2b），在37℃，5％CO₂的条件下培育2天，最少的机械干扰，2天后在载玻片的标记处（图2a）再添加3ml培养基。另一管加4ml培养基，混匀，平铺于组织细胞培养瓶，37℃，5％CO₂的条件下培养。

2)换液：培养7~8天，倒置显微镜下观察生长进展，克隆细胞群较多，面积大，透亮细胞多时，用2ml/瓶新鲜的羊水培养基替换培养基第二天收获。原来的培养物传代到对应组织细胞培养瓶中，继续生长，待出报告后，弃之。

3)收获、制片、放入染色体分散仪器（同前）。

4)显微镜拍取核型。比对分析两种培养体系的培养成功率、细胞克隆数、有效分裂相、核型符合率。

5)临床报告。分析染色体核型，15个核型/人。

国产载玻片与常规塑料瓶原位细胞培养法同步培养100例羊水，两者结果比对如下：

结果显示两种方法培养成功率均为100%，细胞克隆数P=0.497（P>0.05），有效分裂相数P=0.759（P>0.05），认为无统计学差异（表5）。染色体核型结果符合率达100%。初步临床应用显示载玻片原位培养羊水细胞技术可以获得塑料瓶原位培养法同样效果。

总结：

（1）本发明不增加羊水穿刺次数及羊水量，不存在伦理问题，不影响产前诊断程序；

（2）本发明所涉及的试剂主要为自配试剂，原材料均可国内购买，无需额外增加试剂，不增加成本；

（3）本发明采用国产载玻片，其获得的细胞克隆数和有效分裂相数能力不亚于进口载玻片，且国产载玻片价格低；

（4）本发明初步临床应用显示国产载玻片原位培养羊水细胞技术可以获得塑料瓶原位培养法同样效果；

（5）本发明建立的羊水原位培养方法可以用于自动显微镜扫描，解决了产前诊断自动化关键技术，具备培养克隆丰富、制片质量稳定，分裂相优质，成功率高等特点；

综上所述，本技术使羊水细胞在国产载玻片上实现细胞贴壁，获得丰富克隆以及优质分裂相，且价格低廉。在产前诊断自动化流程上解决了关键技术，将会极大提升临床工作效率。