毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方法

摘要

本发明涉及一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方法，属于生物分离分析技术领域。所述方法如下：对反应物进行毛细管区带电泳，进样顺序先后依次为：毛细管中迁移速率慢的反应物，电泳缓冲溶液，毛细管中迁移速率快的反应物，使迁移速率不同的反应物在所述电泳过程的毛细管中实现在线反应混和后完成电泳，分离收集电泳产物，对所述产物进行毛细管电泳-激光诱导荧光检测；所述反应物为蛋白质和ssDNA。所述方法中两种反应物在毛细管电泳过程中完成在线混合及反应，不需孵育；复合物通过在线分离，快速简便；所述方法高效，快速，且样品用量少，利用率高，尤其适用于来源困难，价格昂贵的蛋白质。

说明书

技术领域

本发明涉及一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方法，属 于生物分离分析技术领域。

背景技术

单链寡核苷酸(single-stranded DNA,ssDNA)或RNA具有特定二级结构， 可以与蛋白质分子形成高亲和性和特异性的复合物。寡核苷酸文库是一类含有 10¹³～10¹⁵种不同碱基的单链DNA分子(ssDNA)混合物，其中可能含有一种 或数种能与靶分子具有高特异性，高亲和性结合的ssDNA，即核酸适配体 (Aptamer)。核酸适配体是通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术，从随 机寡核苷酸文库中筛选得到的，具有与靶分子高亲和性和高特异性的寡核苷酸 序列配体，其特性是亲和力高、特异性强、易制备及修饰，并且靶分子分布广。 由于在生物，医药以及分子识别和检测方面有重要的应用价值，目前已经发展 出多种核酸适配体的筛选方法，如亲和色谱，膜过滤，磁珠分离及毛细管电泳 等。

毛细管电泳(CE)具有高效、快速以及实验成本低等优点，是新型的微量 分离分析技术，在蛋白质的核酸适配体筛选中有广泛的应用。

CE用于SELEX筛选核酸适配体即为CE-SELEX。CE-SELEX可使核酸适 配体筛选周期缩短至传统SELEX技术的三分之一，大大加快了筛选效率。由于 传统的CE-SELEX技术中，需将初始的ssDNA文库与靶分子混合孵育，并需要 对孵育的温度、时间以及ssDNA文库与靶分子的比例做一系列优化，使操作复 杂、耗时且样品耗费大。

发明内容

针对传统的CE-SELEX技术筛选适配体时，靶分子用量大、反应条件优化 过程繁琐以及耗时费力的缺陷，本发明的目的在于提供一种毛细管电泳在线反 应分离蛋白质-寡核酸复合物的方法，所述方法基于毛细管电泳的在线反应及分 离方法，用于靶分子核酸适配体的高效筛选。

为实现本发明的目的，采用的技术方案如下。

一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方法，所述在线反应 为本领域常用术语，是指在毛细管区带电泳时毛细管中的反应，所述方法步骤 如下：

对反应物进行毛细管区带电泳，进样顺序先后依次为：毛细管中迁移速率 慢的反应物，电泳缓冲溶液，毛细管中迁移速率快的反应物，使迁移速率不同 的反应物在所述电泳过程的毛细管中实现在线反应混和后完成电泳，分离收集 电泳产物，对所述产物进行毛细管电泳-激光诱导荧光(CE-LIF)检测；所述反 应物为蛋白质和ssDNA，根据本领域毛细管区带电泳的要求制成样品溶液后进 样。

优选在电泳缓冲液中加入反应物之一，可抑制复合物在所述电泳过程中解 离，进而促进较弱复合物的形成。

其中，所述毛细管中的迁移速率可通过分别对反应物，即蛋白质和ssDNA 进行毛细管区带电泳，根据所述反应物的出峰时间确定，先出峰的反应物迁移 速率快。

通过改变所述反应物的进样时间，即进样量，可获得不同反应物的最佳进 样量比例。

所述反应物可通过以下方法制成样品溶液进样：将蛋白质溶于纯水中制成 原始蛋白质储备液，将ssDNA溶于纯水中制备成原始ssDNA储备液；将原始蛋 白质储备液稀释后得到蛋白质样品溶液，将原始ssDNA储备液稀释后得到 ssDNA样品溶液。

优选确定反应物在毛细管中的迁移速率时的毛细管区带电泳使用涂层毛细 管，可抑制蛋白质在管壁的吸附，可采用总长度48.5cm，有效长度40cm，内径 75μm的毛细管；可使用Agilent 7100毛细管电泳仪进行所述电泳；电泳缓冲液 可为硼酸硼砂溶液，可通过将50mM的硼砂溶液与20mM的硼酸溶液按体积比 为3:2混合得到硼酸硼砂溶液，pH值为8.7；进样条件可为：50mbar下，进样 3s～25s，分析条件可为：分析温度25℃，分析电压-15kV；可使用UV 195nm 进行检测。

优选反应物在毛细管区带电泳在线反应时所使用的毛细管为涂层毛细管， 可抑制蛋白质在管壁的吸附，可采用总长度为50.2cm，有效长度为40cm，内径 为75μm的涂层毛细管；可采用Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪进行所述电 泳；电泳缓冲液与确定反应物在毛细管中的迁移速率时的毛细管区带电泳使用 的电泳缓冲液相同，可采用硼酸硼砂溶液，可通过50mM的硼砂溶液与20mM 的硼酸溶液按体积比为3:2混合得到硼酸硼砂溶液，pH值为8.7；进样条件可 为：蛋白质进样：0.5psi，20s；电泳缓冲液进样：0.5psi，10s；ssDNA进样：0.5psi， 10s；分析条件可为：分析温度为25℃，分析电压为-15kV；可采用的毛细管电 泳-激光诱导荧光(CE-LIF)检测条件为：激发波长488nm，发射波长520nm。

有益效果

1.本发明提供了一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方 法，首先进样迁移速率慢的反应物，中间进样电泳缓冲液隔离，然后进样迁移 速率快的反应物，可避免两种反应物提前混合，确保两种反应物在电泳分离开 始后进行在线反应，在毛细管电泳过程中，迁移速率快的反应物会“穿越”迁 移速率慢的反应物区域，并在“穿越”过程中伴随复合物的形成和解离过程； 由于所述方法是将反应物在毛细管内进行在线反应，因此对反应物需求量很少， 且所有反应物都在线参与反应，该方法尤其适用于来源困难，价格昂贵的靶标 反应物；

2.本发明提供了一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方 法，在所述电泳过程中，由于两种反应物是在毛细管中在线反应，省去孵育步 骤，避免繁琐操作；

3.本发明提供了一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方 法，在所述电泳过程中，在电泳缓冲液中分别加入两种反应物之一形成背景缓 冲液，可抑制复合物在毛细管中在线反应时解离，进而促进较弱复合物的形成； 通过增加反应物的进样量可使复合物量增大，有益于收集得到较多的复合物；

4.本发明提供了一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方 法，在所述电泳分离过程中，迁移速率快、慢的反应物以及反应形成的复合物 根据其荷质比大小，依次通过毛细管末端的检测窗口，根据复合物的迁移时间， 计算出复合物迁移至毛细管出口端的时间，进而可在毛细管出口端收集复合物；

5.本发明提供了一种毛细管电泳在线反应分离蛋白质-寡核酸复合物的方 法，由于所述反应物在线进行反应，分离速度快，操作简便，有益于两种反应 物的反应条件优化。

附图说明

图1为实施例1中毛细管区带电泳DAD检测器检测结果图。

图2为实施例2中毛细管区带电泳LIF检测器检测结果图。

图3为实施例3中毛细管区带电泳LIF检测器检测结果图。

图4为实施例4中毛细管区带电泳LIF检测器检测结果图。

图5为实施例5中电泳缓冲液为Apt15-FAM背景缓冲液时，毛细管区带电 泳LIF检测器检测结果图。

图6为实施例5中电泳缓冲液为H-Thr背景缓冲液时，毛细管区带电泳LIF 检测器检测结果图。

图7为实施例6中毛细管区带电泳LIF检测器检测结果图。

具体实施方式

为了充分说明本发明的特性以及实施本发明的方式，下面给出实施例。

以下实施例1中，15碱基H-Thr适配体(Apt15)序列：5'-GGT TGG TGT GGT  TGG-3'，29碱基H-Thr适配体(Apt29)序列：5'-AGT CCG TGG TAG GGC AGG  TTG GGG TGA CT-3'，以上适配体均购自生工生物工程(上海)有限公司；实 施例2～7中，荧光标记15碱基H-Thr适配体(Apt15-FAM)序列：5'-FAM-GGT  TGG TGT GGT TGG-3'，荧光标记29碱基H-Thr适配体(Apt29-FAM)序列： 5'-FAM-AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CT-3'，所述适配体均购 自生工生物工程(上海)有限公司；人凝血酶(H-Thr)购自Enzo Life Science 公司；80荧光库： 5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATG-(40N)-CCTATGCGTGCTACCGTGAA-3'，购 自生工生物工程(上海)有限公司。

反应物在毛细管区带电泳在线反应所使用的毛细管为涂层毛细管，涂层毛 细管购自河北邯郸开发区奥泰克生物科技有限公司；毛细管在线反应采用 Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪，在毛细管出口端配备LIF检测器，检测器 检测条件为：激发波长488nm，发射波长520nm；所用涂层毛细管外包硅胶层， 总长度为50.2cm，有效长度为40cm，内径为75μm；电泳缓冲液是pH值为8.7 的硼酸硼砂溶液，通过将50mM的硼砂溶液与20mM的硼酸溶液按体积比为3: 2混合得到。

实施例1

原始Apt15储备液制备：将购买的Apt15晶体状，经3000转/分钟离心5min， 加入纯水配制成1.0×10^-4mol/L的原始Apt15储备液。

原始Apt29储备液制备：将购买的Apt29晶体状，经3000转/分钟离心5min， 加入纯水配制成1.0×10^-4mol/L的原始Apt29储备液。

原始H-Thr储备液制备：将购买的H-Thr晶体状，经3000转/分离心5min， 加入纯水配制成1.0×10^-4mol/L的原始H-Thr储备液。

(1)将原始Apt15储备液用纯水稀释得到浓度为1.0×10^-5mol/L的Apt15 样品溶液，采用Agilent 7100毛细管电泳仪，经50mbar压力进样10s，以pH值 为8.7的硼酸硼砂溶液为电泳缓冲液，在总长度48.5cm，有效长度40cm，内径 75μm的毛细管中进行毛细管区带电泳，电泳分析时间为20min，分析电压为 -15KV，分析温度为25℃；将原始H-Thr储备液用纯水稀释得到H-Thr样品溶 液，将10μL浓度为1.0×10^-5mol/L的H-Thr样品溶液，采用Agilent 7100毛细 管电泳仪，经50mbar压力进样10s，以pH值为8.7的硼酸硼砂溶液为电泳缓冲 液，在总长度48.5cm，有效长度40cm，内径75μm的毛细管中进行毛细管区带 电泳，电泳分析时间为20min，分析电压为-15KV，分析温度为25℃，毛细管的 出口端为正极，入口端为负极，Apt15和H-Thr的DAD检测器检测结果如图1 左图所示。

图1左图下方谱线为Apt15谱线，在4.5min处产生信号峰；图1左图上方 谱线为H-Thr谱线，由于H-Thr对毛细管壁吸附性较强，所以在10min以后出 现很宽的峰。由此可见，在毛细管中迁移速率：Apt15>H-Thr。由于Apt15-FAM 和Apt15在毛细管中迁移速率基本一致，所以在毛细管中迁移速率： Apt15-FAM>H-Thr。

(2)将步骤(1)中的Apt15换成Apt29，其余同步骤(1)，Apt29和H-Thr 的DAD检测器检测结果如图1右图所示。

图1右图下方谱线为Apt29谱线，在6min处产生信号峰；图1右图上方谱 线为H-Thr谱线，由于H-Thr对毛细管壁吸附性较强，所以在10min以后出现 很宽的峰。由此可见，在毛细管中迁移速率：Apt29>H-Thr。由于Apt29-FAM 和Apt29在毛细管中迁移速率基本一致，所以在毛细管中迁移速率： Apt29-FAM>H-Thr。

实施例2

原始Apt29-FAM储备液制备：将购买的Apt29-FAM晶体状，经3000转/ 分钟离心5min，加入纯水配制成1.0×10^-4mol/L的原始Apt29-FAM储备液；将 原始Apt29-FAM储备液用纯水稀释得到1.0×10^-6mol/L的Apt29-FAM样品溶液； 将实施例1制得的原始H-Thr储备液用纯水稀释得到1.0×10^-6mol/L的H-Thr样 品溶液。

(1)在Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪中进行毛细管区带电泳，分别 取H-Thr样品溶液、电泳缓冲液和Apt29-FAM样品溶液，运行时首先进样迁移 速率慢的H-Thr样品溶液，然后进样电泳缓冲液，最后进样迁移速率快的 Apt29-FAM样品溶液，进样条件如下：H-Thr进样：0.5psi，20s，电泳缓冲液进 样：0.5psi，10s，Apt29-FAM进样：0.5psi，10s，电泳分析时间为20min，分析 电压为-15KV，分析温度为25℃，在毛细管区带电泳过程中所述两种样品溶液 在毛细管中进行混合形成复合物完成电泳，毛细管的出口端为正极，入口端为 负极，进行毛细管电泳-激光诱导荧光检测，LIF检测器检测结果如图2上方谱 线所示。

(2)进样时只进样Apt29-FAM，其余步骤同步骤(1)，LIF检测器检测结 果如图2下方谱线所示。

由图2下方谱线可知，在6min处产生信号峰，所述信号峰为Apt29-FAM信 号峰。由图2上方谱线可知，在6.5min处产生信号峰，比下方谱线Apt29-FAM 信号峰出峰时间慢0.5min，是由于电泳过程中Apt29-FAM要穿过一段H-Thr， 因此其迁移速率减慢，所以确定6.5min信号峰为Apt29-FAM信号峰；与下方谱 线对比，上方谱线中Apt29-FAM信号峰峰高降低，并在11.5min产生了新的信 号峰，是由于部分Apt29-FAM与H-Thr反应生成H-Thr和Apt29-FAM复合物， 所以初步确定11.5min信号峰为H-Thr和Apt29-FAM复合物峰。

实施例3

复合物收集时间的确定：根据公式：出峰时 间采用实施例2中复合物出峰的前后时间(出峰前时间取：9min，出峰后时间 取：13min)，计算出复合物收集时间为：11.3min～16.3min。

复合物的收集：按照实例2的方法进行毛细管区带电泳，当所述电泳运行 到11min时，将毛细管的出口端转移到装有20μL纯水的复合物收集瓶中，为保 证充分收集，继续运行电泳10min，一次收集完成后，用同样的方法在同一收集 瓶中再收集四次H-Thr和Apt29-FAM复合物，共收集到5次H-Thr和Apt29-FAM 毛细管在线反应的复合物。

复合物的检测：将收集到的20μL纯水中的5次复合物，在Beckman P/ACE  MDQ毛细管电泳仪中，经0.5psi压力进样10s，pH值为8.7的硼酸硼砂溶液为 电泳缓冲液，进行毛细管区带电泳，电泳分析时间为20min，分析电压为-15KV， 分析温度为25℃，毛细管的出口端为正极，入口端为负极，进行毛细管电泳-激 光诱导荧光检测，LIF检测器检测结果如图3所示。

由图3可知，收集得到的电泳产物在6min出峰，和实施例1中Apt29-FAM 出峰时间基本一致，说明H-Thr和Apt29-FAM复合在纯水中部分解离成H-Thr 和Apt29-FAM，由于Apt29-FAM有荧光信号，所以检测到Apt29-FAM，并未检 测到H-Thr和Apt29-FAM复合物，由此进一步确定实例2中Apt29-FAM和H-Thr 毛细管在线反应产生了H-Thr和Apt29-FAM复合物。

实施例4

原始Apt15-FAM储备液制备：将购买的Apt15-FAM晶体状，经3000转/ 分钟离心5min，加入纯水配制成1.0×10^-4mol/L的原始Apt29-FAM储备液，将 原始Apt15-FAM储备液用纯水稀释得到1.0×10^-6mol/L的Apt15-FAM样品溶液； 将实施例1制得的原始H-Thr储备液用纯水稀释得到1.0×10^-6mol/L的H-Thr样 品溶液。

(1)在Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪中进行毛细管区带电泳，分别 取H-Thr样品溶液、电泳缓冲液和Apt15-FAM样品溶液，运行时首先进样迁移 速率慢的H-Thr样品溶液，然后进样电泳缓冲液，最后进样迁移速率快的 Apt15-FAM样品溶液，进样条件如下：H-Thr进样：0.5psi，20s，电泳缓冲液进 样：0.5psi，10s，Apt15-FAM进样：0.5psi，10s，电泳分析时间为20min，分析 电压为-15KV，分析温度为25℃，在毛细管区带电泳过程中所述两种样品溶液 在毛细管中进行混合形成复合物完成电泳，毛细管的出口端为正极，入口端为 负极，进行毛细管电泳-激光诱导荧光检测，LIF检测器检测结果如图4上方谱 线所示。

(2)进样时只进样Apt15-FAM，其余步骤同步骤(1)，LIF检测器检测结 果如图4下方谱线所示。

由图4中下方谱线可知，在6min处产生信号峰，为Apt15-FAM信号峰。 由图4中上方谱线可知，在6.5min处产生信号峰，比下方Apt15-FAM信号峰出 峰时间慢0.5min，是由于电泳过程中Apt15-FAM要穿过一段H-Thr，因此其迁 移速率减慢，所以确定6.5min信号峰为Apt15-FAM信号峰；与下方谱线对比， 上方谱线的Apt15-FAM信号峰峰高降低，是由于部分Apt15-FAM与H-Thr反应 生成H-Thr和Apt15-FAM复合物，但并未产生新的信号峰，猜测是由于H-Thr 和Apt15-FAM复合物在电泳过程中解离，所以没有检测到H-Thr和Apt29-FAM 复合物峰。

实施例5

Apt15-FAM背景缓冲液的制备：将实施例4制得的原始Apt15-FAM储备液 用pH值为8.7的硼酸硼砂溶液稀释得到5.0×10^-7mol/L的Apt15-FAM背景缓冲 液。

H-Thr背景缓冲液的制备：将实施例1制得的原始H-Thr储备液用pH至为 8.7的硼酸硼砂溶液稀释得到5.0×10^-7mol/L的H-Thr背景缓冲液。

(1)将实施例4中的电泳缓冲液换成Apt15-FAM背景缓冲液，其余同实 施例4，进行毛细管电泳-激光诱导荧光检测，LIF检测器检测结果如图5所示。

图5中下方谱线是进样时只进样Apt15-FAM的谱线，可知，在Apt15-FAM 背景缓冲液为电泳缓冲液的条件下，在6min出现信号峰，即为Apt15-FAM信 号峰。由图5上方谱线是Apt15-FAM样品溶液和H-Thr样品溶液毛细管在线反 应的谱线，在6min处产生信号峰，与下方谱线Apt15-FAM信号峰出峰时间一 致，所以6min信号峰峰为Apt15-FAM信号峰；与下方谱线对比，上方谱线 Apt15-FAM信号峰峰高降低，并在8.5min产生了新的信号峰，是由于部分 Apt15-FAM与H-Thr反应生成H-Thr和Apt15-FAM复合物，所以确定8.5min 信号峰为H-Thr和Apt15-FAM复合物峰。

(2)将实施例4中的电泳缓冲液换成H-Thr背景缓冲液，其余同实施例4， 进行毛细管电泳-激光诱导荧光检测，LIF检测器检测结果如图6所示。

图6中下方谱线是进样时只进样Apt15-FAM的谱线，可知，在H-Thr背景 缓冲液为电泳缓冲液的条件下，在7.8min出现信号峰，即为Apt15-FAM信号峰； 在13min有信号峰，是由于背景缓冲液中有H-Thr，H-Thr与Apt15-FAM反应 生成H-Thr和Apt15-FAM复合物，所以13min信号峰为H-Thr和Apt15-FAM复 合物峰。图6中上方谱线是Apt15-FAM样品溶液和H-Thr样品溶液毛细管在线 反应的谱线，可知，在7.5min处产生信号峰，与下方谱线Apt15-FAM信号峰出 峰时间基本一致，所以7.5min信号峰为Apt15-FAM信号峰；与下方谱线对比， 上方谱线Apt15-FAM信号峰峰高降低，在10.5min产生了新的信号峰，是由于 部分Apt15-FAM与H-Thr反应生成H-Thr和Apt15-FAM复合物，所以确定 10.5min信号峰为H-Thr和Apt15-FAM复合物峰。

由此说明，在电泳缓冲液中加入电泳反应物之一，本实施例为H-Thr或 Apt15-FAM，可抑制H-Thr和Apt15-FAM复合物在毛细管中在线解离，检测到 复合物，并证实施例4中的猜测。

实施例6

原始80荧光库储备液制备：将购买的80荧光库晶体状，经3000转/分钟离 心5min，加入纯水配制成1.0×10^-4mol/L的原始80荧光库储备液，将原始80荧 光库储备液用纯水稀释得到1.0×10^-6mol/L的80荧光库样品溶液；将实施例1 制得的原始H-Thr储备液用纯水稀释得到1.0×10^-6mol/L的H-Thr样品溶液。

(1)在Beckman P/ACE MDQ毛细管电泳仪中进行毛细管区带电泳，分别 取H-Thr样品溶液、电泳缓冲液和80荧光库样品溶液，根据实施例1中的结果 可知，在毛细管中迁移速率：80荧光库>H-Thr，所以运行时首先进样迁移速率 慢的H-Thr样品溶液，然后进样电泳缓冲液，最后进样迁移速率快的80荧光库 样品溶液，进样条件如下：H-Thr进样：0.5psi，20s，电泳缓冲液进样：0.5psi， 10s，80荧光库进样：0.5psi，10s，电泳分析时间为20min，分析电压为-15KV， 分析温度为25℃，在毛细管区带电泳过程中所述两种样品溶液在毛细管中进行 混合形成复合物完成电泳，毛细管的出口端为正极，入口端为负极，进行毛细 管电泳-激光诱导荧光检测，LIF检测器检测结果如图7上方谱线所示。

(2)进样时只进样80荧光库，其余步骤同步骤(1)，LIF检测器检测结果 如图7下方谱线所示。

由图7中下方谱线可知，在6.5min处产生信号峰，即为80荧光库信号峰。 由图7中上方谱线可知，在6.5min处产生信号峰，与下方80荧光库信号峰出峰 时间一致，所以确定6.5min信号峰为80荧光库信号峰；与下方谱线对比，上方 谱线80荧光库信号峰峰高降低，并在8.5min产生了新的信号峰，是由于部分 80荧光库与H-Thr反应生成H-Thr和80荧光库复合物，所以确定8.5min信号 峰为H-Thr和80荧光库复合物峰。

综上所述，以上仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保 护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。