促进微拟球藻大量积累高不饱和脂肪酸的方法

摘要

本发明公开了一种促进微拟球藻大量积累高不饱和脂肪酸的方法，属水产养殖领域。传统上微拟球藻采用开放型跑道式大池培养，生长慢，操作麻烦，易污染，高不饱和脂肪酸含量低。本发明采用二阶段养殖法，第一阶段在光照培养箱中进行，提供较低的温度和光照强度，有利于藻细胞生长且避免强光对细胞造成光伤害，第二阶段在微藻培养室中采用塑料薄膜袋充气培养，提高了温度和光照，有利于高不饱和脂肪酸积累。本发明还对传统培养液配方进行了优化，补充了人尿，KBr，H3BO3，烟酸，盐酸吡哆醇，土壤浸出液等，营养更全面、均衡，不易污染，成本低，易于操作，高不饱和脂肪酸含量提高140％。

说明书

技术领域

本发明属于水产养殖领域，尤其涉及一种促进微拟球藻大量积累高不饱和脂肪酸的方法。

背景技术

微拟球藻Nannochloropsis oculata，又名微绿球藻、眼点拟微球藻，是直径2-3μm的 真核单细胞绿色微藻，隶属绿藻门，绿藻纲，四胞藻目，胶球藻科，微绿球藻属。细胞内油 脂含量占干重68％以上，油脂以C16和C18脂肪酸为主，是公认的最有希望用于工业化提炼 生物柴油的海洋微藻。另外，该藻还富含高不饱和脂肪酸EPA即二十碳五烯酸，EPA对人体 有重要的生理和保健功能，可辅助防治心脏病、动脉硬化、癌症、气喘、风湿性关节炎、糖 尿病。微拟球藻在有机质多，特别是氮、磷盐丰富的水体中生长旺盛。最适生长温度25-30℃， 在盐度4-36‰范围内均能正常生长，最适光照强度4000-20000lux，适宜pH范围7.5-8.5。

以前，宋理平发明了一种高EPA产率的微拟球藻培养系统及培养方法(申请号 CN201310646558)。该发明在传统环形跑道式培养池外增加太阳能光照循环装置，增强局部 水循环，增大受光面积；同时增设通气总管及支管，利用通气气流驱动培养液不断流动，既 提供了碳源，又使得培养液不断循环，所有藻细胞都能得到充足光照和二氧化碳。本发明还 为微拟球藻三个自然生长阶段提供了不同的培养液配方，使得微拟球藻在密度最大时，EPA 含量最高。该发明生产成本低，EPA产率高，但基建投资大，操作麻烦，易污染。另外，赵 心清公开了一株富含十六碳二烯酸的海洋微拟球藻及提高其生物量和油脂含量的培养方法 (申请号CN201310065178)，通过1/5新鲜培养基置换，该藻株在含有37.5mg/L的f/2培 养基中油脂含量能达到64.3％，在含1.5g/L的BG11培养基中生物量能达到1.4g/L，油脂产 率达到30mg/L/d。在良好培养条件下其油脂中长链饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸含量超过65％， 适合用于生物柴油炼制。但该藻株抗逆性差，不耐低温，难以大规模推广应用。

为了克服目前技术的不足，本发明采用二阶段养殖法，第一阶段在光照培养箱中进行， 提供较低的温度和光照强度，有利于藻细胞生长且避免强光对细胞造成光伤害，第二阶段在 微藻培养室中采用塑料薄膜袋充气培养，提高了温度和光照，有利于高不饱和脂肪酸积累。 本发明还对传统培养液配方进行了优化，补充了人尿，KBr，H₃BO₃，烟酸，盐酸吡哆醇，土 壤浸出液等，营养更全面、均衡，不易污染，成本低，易于操作，高不饱和脂肪酸含量提高 140％。

发明内容

为了克服目前技术的不足，本发明提供了一种促进微拟球藻大量积累高不饱和脂肪酸的 方法，具体方法如下：

步骤1培养液的配制培养液成分：NaCl 25份，NaNO₃ 1.5份，过磷酸钙0.3份，NH₄Cl 1.2份，FeC₆H₅O₇ 0.01份，MgSO₄·7H₂O 5份，人尿1.5份，KBr 0.02份，H₃BO₃ 0.01份， 生物素0.001份，烟酸0.01份，盐酸吡哆醇0.02份，羊粪浸出液2份，土壤浸出液1.2份， 煮沸冷却后的海水1000份；取此培养液2000毫升装入一3000毫升的三角烧瓶，保鲜膜和橡 皮筋封口，放在摇床上摇匀15分钟，放入4℃冰箱保存备用。

步骤2光照培养箱培养取一3000毫升洁净的三角烧瓶，加入步骤1所述培养液1800 毫升，用生长旺盛、无污染、指数生长期的微拟球藻藻种接种，接种密度每毫升3万个细胞， 轻轻摇匀，报纸和橡皮筋封口，放入光照培养箱中培养，调节温度至25℃，光照强度4500lux， 光暗周期＝12h/L+12h/D，即提供间歇光，12小时光照，12小时黑暗，每天手动摇瓶3次，每 次45秒钟，培养至第6天，调节温度至27℃，光照强度6000lux，培养至第11天，转入下 一步骤；

步骤3塑料薄膜袋充气培养取一可装水400升的塑料薄膜袋，装入步骤1所述的培养 液200升，加入步骤2所述的藻液1800毫升，扎紧袋口，充气培养，袋口插入2根管子，一 根为塑料管，长3米，直径8毫米，一端连接空气压缩机，另一端插入到藻液底部，用以充 气，充入混合气体，气体成分＝空气96％+纯CO₂ 4％，连续不间断充气，气量不宜太大，以让藻 细胞浮起不下沉即可；另一根较短，长30厘米，直径10毫米，为比较硬的料管，顶端露出 袋口即可，用以排气；将此塑料袋放入微藻培养室中培养，室内空调控温，日光灯管照明， 以打开灯管的数量多少来控制光照强度，光暗周期＝14h/L+10h/D，即提供间歇光，14小时光 照，10小时黑暗，调节温度至30℃，光照强度12000lux，连续培养9天后，停止培养，转 入下一步骤；

步骤4藻细胞采收将培养后的藻液加入到离心机中，离心5分钟，离心机转速6000 转/分钟，弃上清液，得绿色的粘稠藻泥，采收完毕。

有益结果

以前，微拟球藻采用环形跑道式培养池培养，缺点是EPA产率低，基建投资大，操作麻 烦，易污染，为了克服目前技术的不足，本发明采用二阶段养殖法，第一阶段在光照培养箱 中进行，提供较低的温度和光照强度，有利于藻细胞生长且避免强光对细胞造成光伤害，第 二阶段在微藻培养室中采用塑料薄膜袋充气培养，提高了温度和光照，有利于高不饱和脂肪 酸积累。本发明还对传统培养液配方进行了优化，补充了人尿，KBr，H₃BO₃，烟酸，盐酸吡 哆醇，土壤浸出液等，营养更全面、均衡，不易污染，成本低，易于操作，高不饱和脂肪酸 含量提高140％。

附图说明

图1为显微镜视野下的微拟球藻外部形态；

图2为微拟球藻干藻粉图；

图3为微拟球藻的生长情况，其中横坐标为培养时间(天)，纵坐标为细胞密度，单位是万 个细胞/每毫升藻液。

具体实施方式

步骤1中所述土壤浸出液制备方法：取树林中松散、富含有机质的上层土壤1千克，加 自来水5升，煮沸20分钟，将泥浆倒入烧杯中，静置24小时，后吸取上清液，倒入三角烧 瓶中，加棉花塞，煮沸15分钟，冷却，静置沉淀12小时，取上清液即得土壤浸出液，装入 磨口塞试剂瓶，密封，贴上标签，置于4℃冰箱备用；

步骤1中所述柠檬酸铁(FeC₆H₅O₇)较难溶解，可加少量自来水在火炉上微热至80-90℃， 并不断搅拌至全部融化；

步骤1中所述羊粪浸出液制备方法：将羊粪堆积在阳光下，适当暴晒，使羊粪含水量在 50-75％为宜，用黄泥或塑料薄膜密封发酵，春秋季需一个月，夏季半月即可。发酵好之后， 要先将其稍晾。取发酵好的羊粪1000克，置入大小适当的瓷缸，加水10升，充分搅拌15分 钟，静置72小时，取上清液4升，煮沸10分钟，冷却，静置48小时，取上清液2升备用；

步骤1中所述人尿制备方法：取一3000毫升三角烧瓶，装入人尿1500毫升，静置，自 然发酵48小时，放在电炉上加热，煮沸3分钟，冷却，装入磨口塞棕色试剂瓶，密封，置于 4℃冰箱冷藏备用；

步骤2中接种用的微拟球藻预先进行提纯(本领域常规方法，只要可实现提纯即可，例 如高氏提取法)，以确保接种时藻种为纯种且处于生长旺盛的指数生长期；

步骤1中各种营养盐要按配方中提供的顺序加入，以免发生化学反应；

步骤1中各种无机营养盐和维生素可预先配成母液且置于4℃冰箱冷藏保存备用，放置 时间不要超过30天；

步骤1和2中所用三角烧瓶等玻璃仪器均需洗刷干净放在70℃烘箱中烘干后使用；

步骤2所述接种过程需在上午9-10点且在无菌操作台上进行；

步骤2中所用塑料薄膜袋要求较厚且质地坚韧，下面铺一层破旧毛毯或床单之类，以防划 破；

步骤1中所用化学药品纯度均需化学纯级别。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照 前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前 述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改 或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。