血清脂类、脂蛋白及载脂蛋白高效浓缩提取方法

摘要

本发明提供了一种从血清中浓缩提取脂类、脂蛋白和载脂蛋白的新方法。该方法充分利用阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂的搭配使用，采用合适的沉淀剂浓度，并控制沉淀时间，使得到的溶解液中各种成分的比例接近原血清中各种成分的比例，且减少了操作步骤。所得的血清脂类、脂蛋白和载脂蛋白仍保持较好的水溶性和生物活性。该法简单、高效，适合大规模制备，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及到一种血清中脂类、脂蛋白和载脂蛋白的提取浓缩方法。

背景技术

近年来，随着生活水平的提高和生活方式的改变，心脑血管疾病已成为威胁人类生命健康的头号杀手。目前我国已有超过1.6亿人患有高血脂，有上千万的心脑血管疾病病人，平均每十几秒就有一人死于心脑血管病。这使得心脑血管疾病超过癌症、乙肝、艾滋病等，成为我国死亡率最高的一类疾病。

这类疾病涉及到血清中的脂类以及相关的蛋白浓度的异常,这些物质主要有胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白A1(ApoA1)、载脂蛋白AII(ApoAII)、载脂蛋白B(ApoB)、载脂蛋白E(ApoE)、载脂蛋白D(ApoD)、载脂蛋白H(ApoH)以及脂蛋白(a)(Lp(a))等，这些物质在血液中的运输和代谢情况与人的健康有着密切联系。部分物质的含量或结构发生变化预示着人体健康状况的改变。所以对于这些脂类、脂蛋白和载脂蛋白的研究有重要意义，因而成为学界的热点。而其中具有重要诊断学意义的有TC、TG、HDL-C、LDL-C、ApoA1、ApoB和Lp(a)。本发明即以以上七种物质作为目标进行研究。

浓缩提取得到符合条件的血清脂质、脂蛋白和载脂蛋白是进行后续研究的关键，而国内外关于血清脂蛋白和载脂蛋白的提取浓缩的方法有很多。如超高速离心法，虽然方法操作也很简便，只需用盐(如NaCl、KCl、NaBr等)来调节血清的密度，然后用离心机分离，调节合适的转速就可使相关脂类、脂蛋白和/或载脂蛋白有较好的分离，但是所使用的超高速离心机价格昂贵，一般实验室很难装备；其他提取方法还有毛细管电泳法，此法对少量样品可以得到较好的分离效果，但不适用于大规模血清脂蛋白的浓缩提取，且电泳后蛋白质大多已变性，难以进行后续研究；此外还有层析柱色谱法，这类方法都需要用到色谱填料，价格昂贵，所需成本较高，只适合于制备高纯度的蛋白。另外也有报道用有机溶剂提取脂蛋白，但是使用有机溶剂后脂蛋白的水溶性会降低，影响后续应用。

因此，本发明迫切需要开发一种高效、成本低廉、适合大规模浓缩提取的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效、简便，适合大规模浓缩提取脂蛋白和载脂蛋白的方法。

本发明第一方面提供了一种从血清中提取脂蛋白及载脂蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)向血清原料中加入阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂，获得第一混合物，并对所述第一混合物静置后离心，分别得到上清液甲及沉淀乙；

(b)向上清液甲加入阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂，获得第二混合物，并对所述第二混合物静置后离心，分别得到上清液丙及沉淀丁；

(c)将沉淀乙和沉淀丁合并，加入沉淀溶解液溶解，形成合并溶液；

(d)对所述合并溶液进行离心，获得上清液，即为含有目标脂蛋白和载脂蛋白的溶液。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(e)对步骤(d)中的所述上清液进行检测，其中，检测目标脂类、脂蛋白和载脂蛋白选自下组：

胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白A1(ApoA1)、载脂蛋白B(ApoB)、脂蛋白(a)(Lp(a))或其组合。

在另一优选例中，所述的检测项目包括定性或定量检测。

在另一优选例中，步骤(a)中的阴离子沉淀剂选自下组：硫酸右旋糖苷(Dextran sulface,DS)和肝素盐；和/或

二价金属阳离子沉淀剂包括阳离子选自下组的盐类：Ca²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺或其组合。

在另一优选例中，所述的盐类为可溶性盐类。

在另一优选例中，阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂的组合为DS和CaCl₂。

在另一优选例中，步骤(a)中，在所述第一混合物中，阴离子沉淀剂的最终浓度范围为0.02％-0.1％，优选地，为0.04-0.06％(w/w)；和/或

在所述第一混合物中，二价金属阳离子沉淀剂的最终浓度范围为0.02mol/L-0.2mol/L，优选地，为0.08mol/L-0.15mol/L。

在另一优选例中，步骤(a)中静置时间为10-20小时，较佳地为12-18小时，和/或静置温度为0-4℃；和/或

步骤(b)中静置时间为2-4小时，和/或静置温度为0-4℃。

在另一优选例中，步骤(a)和步骤(b)的离心条件包括：转速为3000-5000r/min，离心时间为20-60min；和/或

步骤(d)中的离心条件包括：转速为10000-15000r/min，离心时间为20-60min。

在另一优选例中，在步骤(c)中，先用沉淀溶解液将沉淀乙溶解，获得第一溶液，然后放置备用；

并在获得沉淀丁后，将所述沉淀丁与所述第一溶液合并，充分溶解，获得所述合并溶液。

在另一优选例中，所述的沉淀溶解液选自下组:Triton X-114、NaCl、NP-40、SDS、DOC和Triton X-100,K₂C₂O₄或其组合物。

在另一优选例中，血清与沉淀溶解液的体积比范围为100:1-20:1，较佳的为80:1-20:1，更佳的为60:1-20:1。

在另一优选例中，所述的沉淀溶解液含有选自下组的一种或多种组分：

K₂C₂O₄：0.2-1mol/L；

SDS：0.5-2％(w/w)；

DOC：0.2-1％(w/w)；

NP-40：0.5-1.5％(w/w)；

Triton X-114：1-3％(v/v)；

Triton X-100：1-3％(v/v)；

NaCl：100-200mmol/L。

在另一优选例中，所述沉淀溶解液中含有0.25M的K₂C₂CO₄或其与其他所述组分的组合。

在另一优选例中，步骤(b)中，所述第二混合物中，阴离子沉淀剂的最终浓度范围为0.5-1％(w/w)，优选地，为0.6-0.8％(w/w)；和/或

步骤(b)中，所述第二混合物中，二价阳离子沉淀剂的最终浓度范围为0.1mol/L-0.5mol/L，优选地，为0.1-0.3mol/L。

在另一优选例中，所述阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂的组合为DS和CaCl₂。

在另一优选例中，所述的脂类、脂蛋白和载脂蛋白选自下组：胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白A1(ApoA1)、载脂蛋白B(ApoB)、脂蛋白(a)(Lp(a))或其组合。

本发明的第二方面提供了一种血清中脂类、脂蛋白及载脂蛋白的提取物，所述的提取物是用本发明第一方面的方法制备的。

在另一优选例中，所述的提取物含有选自下组的7种脂类、脂蛋白和载脂蛋白：胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白A1(ApoA1)、载脂蛋白B(ApoB)、脂蛋白(a)(Lp(a))或其组合。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了血清原料。

图2显示了所得第一混合物。

图3显示了第一混合物离心后的分层状态。

图4显示了第一混合物离心分离后的沉淀乙和上清甲。

图5显示了第二混合物。

图6显示了第二混合物离心之后的状态。

图7显示了第二混合物离心后的上清丙和加入了沉淀溶解液的沉淀丁。

图8显示了沉淀乙和沉淀丁合并加入沉淀溶解液离心后的产物，上清即为含有目标蛋白的溶液。

具体实施方式

本发明人经过长期广泛而深入的试验，通过实验和筛选，首次成功开发了一种高效方便地从血清中浓缩提取脂蛋白和载脂蛋白的方法。本发明方法不仅操作简单，提取效率高，而且特别适合大规模制备。用本发明方法制备的脂蛋白和载脂蛋白提取物可充分保持了其水溶性和生物活性。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“脂蛋白”指脂质与蛋白通过非极性相互作用结合在一起形成的脂质-蛋白质复合物。

如本文所用，术语“载脂蛋白”指脂蛋白中的蛋白质部分。

如本文所用，术语“非离子型去污剂”指在水溶液中不产生离子的表面活性剂，这类表面活性剂通常同时具备亲水和亲脂的基团。

脂蛋白

脂蛋白是脂质与蛋白通过非极性相互作用结合在一起形成的脂质-蛋白质复合物。

常见的脂蛋白有高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、中等密度脂蛋白(IDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)和脂蛋白(a)(Lp(a))等。

载脂蛋白

载脂蛋白是脂蛋白中的蛋白质部分。常见的载脂蛋白载有脂蛋白A1(ApoA1)、载脂蛋白AII(ApoAII)、载脂蛋白B(ApoB)、载脂蛋白E(ApoE)、载脂蛋白D(ApoD)、载脂蛋白H(ApoH)以及载脂蛋白(a)(Ap(a))等。

在诊断学上具有重要意义的脂类、脂蛋白和载脂蛋白有TC、TG、HDL-C、LDL-C、ApoA1、ApoB和Lp(a)。本发明以以上七种物质作为目标进行研究。

非离子型去污剂

非离子型去污剂是在水溶液中不产生离子的表面活性剂，同时具备亲水和亲脂基团，对于增加脂蛋白的溶解性有良好的效果，但又不至于像离子型去污剂那样可能导致蛋白质变性，这样保证了脂蛋白最大限度的溶解。

在本发明中，代表性的非离子型去污剂包括(但并不限于)：NP-40、DOC、Triton X-114、Triton X-100或其组合。

提取方法

本发明的提取方法为化学沉淀法，采用阴离子沉淀剂和二价金属阳离子组合，与血清中的脂类及其相关脂蛋白复合物相结合形成更大的复合物颗粒，表现为血清溶液变浑浊，较易沉淀。然后通过离心使脂类及其相关脂蛋白与沉淀剂形成的复合物沉淀而与血清中的其他成分分离。沉淀之后采用特定的沉淀溶解液，破坏沉淀剂与脂类及其相关脂蛋白形成的复合物结构，释放出脂类及其相关脂蛋白，并使这些脂类及其相关脂蛋白呈溶解状态，而二价阳离子及其他成分则形成沉淀，通过离心分离即可得到目标脂蛋白溶液。

本发明主要优点：

本发明的主要优点是步骤简单，实验所需设备普通，适合大规模生产，并且目标物回收率很高，得到的目标蛋白溶液充分保持了其水溶性和生物活性，可以作为大多数血清脂蛋白分离纯化的第一步分离步骤，也可直接作为体外诊断试剂校准品、质控品的原料，有广泛的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

沉淀剂筛选试验

实验仪器

所述自动分析仪为CA400自动化生化分析仪，日本古野电器株式会社生产，蓝怡公司贴牌销售。

在本实施例中，通过使用不同的沉淀剂组合，从而确定优化的沉淀剂组合。

具体而言，方法包括：

(a)向血清原料1000ml中加入阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂，获得第一混合物，并对所述第一混合物静置后离心，分别得到上清液甲及沉淀乙；

(b)向上清液甲加入阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂，获得第二混合物，并对所述第二混合物静置后离心，分别得到上清液丙及沉淀丁；

(c)将沉淀乙和沉淀丁合并，加入溶解液，形成合并溶液；

(d)对所述合并溶液进行离心，获得上清液，即为含有目标脂蛋白和载脂蛋白的溶液。

(e)将步骤(d)的上清液，在自动分析仪上检测TC、TG。HDL-C、LDL-C、ApoA1、ApoB和Lp(a)项目进行定值，并将各项目测定值记录在管上，-20℃低温保存备用。

其中，在步骤(a)、(b)中添加的阴离子沉淀剂和二价金属阳离子沉淀剂见表1。

在步骤(a)中，静置条件为静置时间为10-20小时，较佳地为12-18小时，和/或静置温度为0-4℃；离心条件为转速为3000-5000r/min，离心时间为20-60min。

在步骤(b)中，静置条件为静置时间为2-4小时，和/或静置温度为0-4℃；离心条件为转速为3000-5000r/min，离心时间为20-60min。

在步骤(d)中，离心条件为转速为10000-15000r/min，离心时间为10-50min。

由以上实验步骤所得到的产物经过仪器检测，结果见表2.

表1：沉淀所用的阴离子沉淀剂与二价阳离子组合及其浓度

表2：各种沉淀剂组合最优化后步骤(d)所得上清液中各成分的量及损失率

结果表明，选用DS+CaCl₂组合有较低的目标物总体损失率。

实施例2

提取方法的进一步优化

在本实施例中，在实施例1的基础上，进一步对组合沉淀剂的浓度选择进行优化。实验方法同实施例1，不同点在于选用不同浓度的DS和CaCl₂，其浓度组合见表3。最后用相同体积的同一溶解液溶解后经仪器检测。检测所得结果见表4。

表3：阴离子沉淀剂与二价阳离子浓度组合

表4：DS与CaCl₂各浓度组合沉淀结果

结果表明，选用第二组组合所得沉淀溶解液具有较高的目标物浓，上清液中有较低的目标物浓度，即具有较好的沉淀效果。

实施例3

沉淀溶解及回收率实验

由于沉淀得到的目标产物存在疏水基团，故水溶性较差。本研究在沉淀步骤及沉淀剂组合及浓度相同的条件下，通过对比几种脂蛋白溶解液，得到了较好的效果，各溶解液见表5，所得溶解产物经过仪器检测，结果见表6。同时，各成分溶解性能存在差异，特别是Lp(a)与其他成分溶解性差异明显，故在溶解后将沉淀再做一次溶解，加入溶解液体积为第一次收集沉淀溶解液终体积的一半，可得到高浓度的Lp(a)，最终得到的各成分的总回收率见表7。

表5：各沉淀溶解液配方

表6：各沉淀溶解液溶解的结果

从各溶解液溶解得到的各项目值分析，溶解液③具有较好的综合溶解效果。根据溶解液试验的结果，选择溶解液③为最终溶解液，经过两次溶解，得到溶解产物经过仪器检测，结果如下表7。

表7：溶解后各目标产物的回收率

结果讨论：

从以上结果可知，除TG外，各产物都得到了较高的回收率。虽然TG回收率不高，但是在用作体外诊断校准品原料时，可用甘油代替；如果需要回收甘油三酯，在溶解沉淀后离心所得的溶液的管壁漂浮物即为甘油三酯(TG)，可以单独收集。另外，在第二次溶解得到的溶液中，Lp(a)的浓度较高，可用于进一步纯化得到LP(a)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。