一种不明确混合菌群发酵木质纤维素生产己酸和辛酸的方法

摘要

本发明属于木质纤维素生物转化技术领域，具体涉及一种利用不明确混合菌群发酵木质纤维素生产己酸和辛酸的方法，其主要步骤如下：①木质纤维素生物质经碱浸泡预处理或蒸汽爆破预处理后作为发酵原料；②采集不同生境的土壤或其他固体样品，以木质纤维素和乙醇为主要碳源进行不明确混合菌群的驯化和选育，获得的不明确混合菌群作为己酸和辛酸的发酵菌种；③接种该不明确混合菌群于含预处理木质纤维素的发酵培养基中，进行厌氧发酵生产己酸和辛酸。本发明的不明确混合菌群发酵工艺无需添加纤维素酶制剂且无需灭菌，具有操作简单、成本低廉、污染低以及木质纤维素利用率高等优点。

说明书

技术领域

本发明属于木质纤维素生物转化技术领域，具体涉及一种利用不明确混合菌群发酵木质纤维素生产己酸和辛酸的方法。

背景技术

依赖于石油、煤炭及天然气等化石资源的现代化工是人类生存和社会发展的重要基础之一。然而，由于化石资源本身带有明显的不可持续性，化工体系同样面临着巨大挑战：①保障廉价的、稳定的原材料供应；②实现向经济的、环保的、可持续的绿色化学工业的迅速转变。另一方面，农作物秸秆是一种储量丰富价格低廉的可再生资源。然而，由于农业的现代化，工业性生产要素对传统农业生产要素的替代，大量过剩的农作物秸秆被丢弃，更有接近总量20%的秸秆被露天焚烧。秸秆焚烧产生大量烟雾烟尘、温室气体CO₂、以及CO、NOx、苯及多环芳烃等有害气体，这既浪费资源，还污染环境。在资源与环境的双重制约压力下，利用碳中立的秸秆类木质纤维生物质转化生物燃料和生物基产品是一种具有广泛前景的替代技术。

己酸和辛酸是两种广泛应用于化工、橡胶、食品饮料和制药业的中链脂肪酸。己酸可用于调配各类香精和作为原料合成其他食品香料，主要用于干酪、奶油和水果香精中；医药中用于制备己雷琐辛；亦可用作润滑油的增稠剂、橡胶加工助剂、清漆催干剂等。辛酸用于生产染料、药物、香料、增塑剂、润滑剂等，也用作防腐剂、杀菌剂的原料。目前，己酸和辛酸的工业生产主要分别以石油、煤炭和天然气等化石资源为基础，仲辛醇用硝酸氧化法制得，辛酸通过辛醛氧化法合成。然而，化石资源的有限性和不可持续性及其开采和使用带来的环境污染，迫使人们寻求能够与自然和谐的可持续生产方法。以可再生生物质为原料，通过微生物发酵生产己酸和辛酸是一种极具潜力的替代技术。尽管目前发酵法的生产成本较高，但随着原油价格的不断攀升、生物质化工的发展成熟，以及食品添加剂、制药与防腐剂领域对有机天然产品需求的增加，发酵法生产的己酸和辛酸将在己酸和辛酸供应市场扮演更重要角色。

己酸和辛酸发酵的传统原料是葡萄糖、蔗糖和淀粉类原料，而这些原料的价格相对较高，使得生产成本较高。利用纤维素类原料，尽管在原料上具有优势，但纤维素酶的制备及酶解成本昂贵，远远抵消了其原料价格优势。本发明采用基于不明确混合菌群的发酵工艺，以木质纤维素为原料，不需要在发酵过程中额外添加纤维素酶，进行中链脂肪酸己酸和辛酸生产。本发明为己酸和辛酸的生产提供一种新方法，极大地降低发酵法生产己酸和辛酸的成本。

发明内容

为了克服以木质纤维素原料发酵法生产己酸和辛酸时纤维素酶解成本高昂的问题，本发明提供一种避免使用纤维素酶制剂的己酸和辛酸发酵方法。本发明提出的技术方案为一种木质纤维素生产己酸和辛酸的混合菌群发酵工艺，包括木质纤维素生物质的氢氧化钠预处理或蒸汽爆破预处理、不明确混合菌群的选育、己酸和辛酸发酵。

上述工艺中的氢氧化钠预处理具体包括以下工序：水稻秸秆切割成10～15 cm，香蕉茎秆切成长10～15 cm、宽3～5 cm的片段，晾干，浸泡于0.5～2%的NaOH溶液中，固-液比为1:15～1:10（w/v），室温或50℃浸泡72～96 h后过滤，将固体残留物用自来水彻底清洗至接近中性，挤干后用作发酵原料。

上述工艺中的蒸汽爆破预处理具体包括以下工序：香蕉茎秆切成长5～10 cm、宽2～3 cm的片段，晾干，加入已预热的蒸汽爆破装置中，2.5 Mpa下维压120 s，爆破完成后收集固体残渣用作发酵原料。所述蒸汽爆破装置可选用市售蒸汽爆破仪，主要部分包括蒸汽发生器、恒压反应器；恒压反应器呈直立圆筒状，放入物料随即通入高温高压蒸汽，达到维压时间后，恒压反应器底部球阀打开释放压力，爆破完成。

上述工艺中的不明确混合菌群的选育具体包括以下工序：采集不同生境的距表面10～20 cm的土壤或其他固体样品，取1 g样品（以干重计）接种至装有200 mL选育培养基的血清瓶中，35℃条件下140 rpm培养；当发酵液pH低于6.0时，用NaHCO₃调节至pH6.5；当乙醇浓度低于0.5g/L时，补充乙醇至2 g/L，如此连续培养至乙醇浓度不再降低；该培养液用作己酸和辛酸发酵的接种物。上述选育培养基配方为10 g/L NaOH 预处理水稻秸秆（以干重计），5 g/L 蛋白胨，1 g/L 酵母粉，5 g/L NaCl，2 g/L CaCO₃ 、0.5 g/L 半胱氨酸、0.01 g/L氯仿和2 g/L乙醇；向装有200 mL培养基的500 mL血清瓶中连续通入氮气十分钟以保证培养基达到完全厌氧状态，将血清瓶密封。

上述工艺中的己酸和辛酸发酵具体包括以下工序：在500 mL血清瓶中加入200 mL 含20 g/L预处理水稻秸秆或香蕉茎秆的发酵培养基；以前述不明确混合菌群为接种物，接种量5 mL/瓶，于35℃条件下，140 rpm培养；定期取发酵液，测定pH和己酸和辛酸含量；当pH低于5.5时，在通入氮气的条件下将发酵瓶打开，加入适量的NaHCO₃将pH调节至6.5；当乙醇浓度低于0.5 g/L时，补充乙醇至2 g/L，如此连续培养20 d。上述发酵培养基包括两类，发酵培养基Ⅰ的配方为20 g/L NaOH 预处理木质纤维素（以干重计），5 g/L 蛋白胨，1 g/L 酵母粉，5 g/L NaCl，2 g/L CaCO₃ 、0.5 g/L 半胱氨酸、0.01 g/L氯仿和2 g/L乙醇，发酵培养基Ⅱ中不添加乙醇，其他成分同发酵培养基Ⅰ；发酵培养基的配制同选育培养基。上述己酸和辛酸含量采用气相色谱法测定：1.5 mL发酵液样品8000 rpm离心5 min，取1 mL上清，加入0.1 mL 25%磷酸溶液混匀；气相色谱仪装配火焰离子化检测器和FFAP毛细管柱；汽化室、柱温和检测器温度分别设定为220°C，180°C和220℃。

具体实施方式

实施例1

本实例所述一种不明确混合菌群发酵NaOH预处理水稻秸秆生产己酸和辛酸的方法，其工艺步骤如下：

（1）水稻秸秆切割成10～15 cm，晾干，浸泡于1%的NaOH溶液中，固-液比为1:15（w/v），50℃浸泡72 h后过滤，将固体残留物用自来水彻底清洗至接近中性，挤干后用作发酵原料。

（2）向装有200 mL选育培养基的500 mL血清瓶中连续通入氮气十分钟以保证培养基达到完全厌氧状态，将血清瓶密封置。不明确混合菌群选育培养基的配方为10 g/L NaOH 预处理水稻秸秆（以干重计），5 g/L 蛋白胨，1 g/L 酵母粉，5 g/L NaCl，2 g/L CaCO₃ 、0.5 g/L 半胱氨酸、0.01 g/L氯仿和2 g/L乙醇。

（3）采集猪粪堆肥表面20 cm以下的固体样品，取1 g样品（以干重计）接种至步骤（2）配制的选育培养基中，35℃条件下140 rpm培养；当发酵液pH低于6.0时，用NaHCO₃调节至pH6.5；当乙醇浓度低于0.5g/L时，补充乙醇至2 g/L，如此连续培养至乙醇浓度不再降低；该培养液用作己酸和辛酸发酵的接种物。

（4）于500 mL血清瓶中加入200 mL发酵培养基Ⅰ，配方为20 g/L NaOH 预处理水稻秸秆（以干重计），5 g/L 蛋白胨，1 g/L 酵母粉，5 g/L NaCl，2 g/L CaCO₃ 、0.5 g/L 半胱氨酸、0.01 g/L氯仿和2 g/L乙醇，其配制同选育培养基；以5%的接种量接入步骤（3）获得的不明确混合菌群进行己酸和辛酸发酵，发酵条件同该不明确混合菌群的选育；20 d后测定发酵液中己酸和辛酸含量。

本实例以NaOH预处理水稻秸秆为原料，利用不明确混合菌群进行己酸和辛酸发酵，获得的己酸产量和辛酸产量分别为6.7 g/L 和0.54 g/L。

实施例2

本实例所述一种不明确混合菌群发酵NaOH预处理水稻秸秆生产己酸和辛酸的方法，其工艺步骤（1）、（2）和（3）同实施例1；步骤（4）中以发酵培养基Ⅱ替代发酵培养基Ⅰ，发酵培养基Ⅱ配方为20 g/L NaOH 预处理水稻秸秆（以干重计），5 g/L 蛋白胨，1 g/L 酵母粉，5 g/L NaCl，2 g/L CaCO₃ 、0.5 g/L 半胱氨酸和0.01 g/L氯仿，其余工艺参数同实施例1。

本实例以NaOH预处理水稻秸秆为原料，利用不明确混合菌群进行己酸和辛酸发酵，获得的己酸产量和辛酸产量分别为4.8 g/L 和0.44 g/L。

实施例3

本实例所述一种不明确混合菌群发酵NaOH预处理香蕉茎秆生产己酸和辛酸的方法，其工艺步骤（1）中以香蕉茎秆替代水稻秸秆，香蕉茎秆切成长10～15 cm、宽3～5 cm的片段；步骤（2）和（3）同实施例1；步骤（4）中发酵培养基Ⅰ的NaOH预处理水稻秸秆替代为NaOH预处理香蕉茎秆，其余工艺参数同实施例1。

本实例以NaOH预处理香蕉茎秆为原料，利用不明确混合菌群进行己酸和辛酸发酵，获得的己酸产量和辛酸产量分别为6.3 g/L 和0.61 g/L。

实施例4

本实例所述一种不明确混合菌群发酵NaOH预处理香蕉茎秆生产己酸和辛酸的方法，其工艺步骤（1）、（2）和（3）同实施例3；步骤（4）中发酵培养基Ⅱ的NaOH预处理水稻秸秆替代为NaOH预处理香蕉茎秆，其余工艺参数同实施例2。 

本实例以NaOH预处理香蕉茎秆为原料，利用不明确混合菌群进行己酸和辛酸发酵，获得的己酸产量和辛酸产量分别为4.2 g/L 和0.51 g/L。

实施例5

本实例所述一种不明确混合菌群发酵蒸汽爆破预处理香蕉茎秆生产己酸和辛酸的方法，其工艺步骤（1）中，香蕉茎秆切成长5～10 cm、宽2～3 cm的片段，晾干，加入已预热的蒸汽爆破装置中，2.5 Mpa下维压120 s，爆破完成后收集固体残渣用作发酵原料；（2）和（3）同实施例1；步骤（4）中发酵培养基Ⅰ的NaOH预处理水稻秸秆替代为蒸汽爆破预处理香蕉茎秆，其余工艺参数同实施例1。

本实例以蒸汽爆破预处理香蕉茎秆为原料，利用不明确混合菌群进行己酸和辛酸发酵，获得的己酸产量和辛酸产量分别为7.3 g/L 和0.55 g/L。

实施例6

本实例所述一种不明确混合菌群发酵蒸汽爆破预处理香蕉茎秆生产己酸和辛酸的方法，其工艺步骤（1）、（2）和（3）同实施例5；步骤（4）中发酵培养基Ⅱ的NaOH预处理水稻秸秆替代为蒸汽爆破预处理香蕉茎秆，其余工艺参数同实施例2。

本实例以蒸汽爆破预处理香蕉茎秆为原料，利用不明确混合菌群进行己酸和辛酸发酵，获得的己酸产量和辛酸产量分别为5.2 g/L 和0.48 g/L。