含离子液体共溶剂介质中制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法

摘要

本发明提供了一种在含离子液体共溶剂体系中制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法，本发明采用重组基因工程菌不对称还原3,5-双三氟甲基苯乙酮时，在反应体系中加入离子液体，通过改善细胞膜的通透性和对底物的增溶，可有效提高底物的溶解度，并减少底物和产物对反应的抑制作用，从而提高反应的底物浓度和反应效率，反应的底物浓度可由50mM提高到1200mM，且在底物浓度为1200mM时，产率由水相还原的70.4％提高到93.8％，产率提高了33.2％，ee值大于99％。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种基因工程菌及其应用，特别涉及一种重组大肠杆菌工程菌及其在含离子液体共溶剂体系中生物还原制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法。

(二)背景技术

2003年美国FDA批准上市的第一个神经激肽-1(NK-1)受体阻滞剂药物，即阿瑞吡坦(Aprepitant，商品名：)。该药物通过与NK-1受体结合从而阻断P物质的作用来达到止吐的效果，广泛应用于治疗癌症病人化疗时产生的恶性呕吐的副作用。2008年在美国、瑞典、捷克、葡萄牙和英国等国上市了另一个止吐药物，即福沙吡坦(Fosaprepitant，商品名：)，该药物是阿瑞吡坦的前体药物，在体内能迅速转化成阿瑞吡坦从而发挥止吐效果。(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇是合成阿瑞吡坦和福沙吡坦等化疗止吐药物的关键手性模块。

离子液体是一类具有不易挥发，不易燃和高稳定性等独特性能，可作为纯溶剂，辅助溶剂，或与其他溶剂一起构成两相体系广泛应用于生物催化、有机合成、化学分离等反应过程。离子液体可通过匹配特定需求的阳离子或阴离子改变其性质，从而有利于提高生物催化剂的催化效率。近年来，有关含离子液体介质中的生物催化过程研究使得生物催化剂的催化活性、立体选择性和稳定性相应的得到提高。

离子液体介质中重组工程菌生物还原3,5-双三氟甲基苯乙酮(BTAP)制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇((R)-BTPE)的反应过程如图1所示。

本申请人的在先申请中国专利2013101896727(公开号CN103421823A)提供了一种以重组工程菌或其表达的短链脱氢酶为生物催化剂，对一些潜手性酮不对称还原获得相应手性醇的方法。该方法在水相体系中进行，且只有在较低的底物浓度下(50mM)，产率才能达到90％以上，当底物浓度大于200mM时，由于底物3,5-双三氟甲基苯乙酮在水相中的低溶解性引起的传质问题，以及底物对细胞的潜在毒性限制了反应的底物浓度的进一步提高，造成产率偏低。

本申请采用含离子液体介质体系进行重组工程菌催化不对称还原反应，由于离子液体对底物具有增溶作用，可有效解决非天然底物水难溶性问题；且离子液体的加入可改变作为催化剂的全细胞的细胞膜通透性，减少底物和产物的抑制作用；从而提高了还原反应的效率。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种在含离子液体共溶剂的反应体系中有效提高重组基因工程菌在高底物浓度(200～1500mM)条件下不对称还原3,5-双三氟甲基苯乙酮制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的产率的新方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种在含离子液体共溶剂体系中制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的方法，所述方法为：以3,5-双三氟甲基苯乙酮为底物，以重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂，以式(Ⅰ)所示离子液体和pH6.0～8.0(优选pH7.0)磷酸盐缓冲液为反应介质构成反应体系，于20～45℃、200rpm条件下进行生物催化不对称还原反应，反应完全后，反应液经分离纯化得到(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇；所述重组基因工程菌是由来源于雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904短链脱氢酶突变体基因构建的重组表达载体转化宿主菌获得的，所述短链脱氢酶突变体基因的核苷酸序列为SEQ IDNO.3所示；所述底物的初始浓度为200mM～1500mM(优选1200mM)，所述湿菌体的用量以反应体系总体积计为20～200g/L(优选50g/L)，所述离子液体的质量用量以反应体系总体积计为10～50g/L(优选35g/L)，所述异丙醇的体积终浓度为10～50％(优选20％)；

[N_R1,R2,R3,R4]L

(Ⅰ)

式(Ⅰ)中阳离子为取代季铵盐，阴离子为天然氨基酸、四氟硼酸盐、六氟磷酸盐、双(三氟甲烷磺酰)亚胺盐，其中取代季铵盐的取代基R1、R2、R3和R4各自独立为C1～C4的烷基。

本发明所述离子液体的制备方法参照在先申请(申请号201310754767，公开号CN103695480A)，优选所述离子液体为下列之一：四甲基铵半胱氨酸([N1,1,1,1][Cys])、四乙基铵半胱氨酸([N2,2,2,2][Cys])、四甲基铵谷氨酸([N1,1,1,1][Glu])、四乙基铵谷氨酸([N2,2,2,2][Glu])、四甲基铵六氟磷酸([N1,1,1,1][PF₆])、四乙基铵六氟磷酸([N2,2,2,2][PF₆])、四丙基铵六氟磷酸([N3,3,3,3][PF₆])、四丁基铵六氟磷酸([N4,4,4,4][PF₆])、四甲基铵四氟硼酸([N1,1,1,1][BF₄])、四乙基铵四氟硼酸([N2,2,2,2][BF₄])、四丙基铵四氟硼酸([N3,3,3,3][BF₄])、四丁基铵四氟硼酸([N4,4,4,4][BF₄])、四甲基铵双(三氟甲烷磺酰)亚胺盐([N1,1,1,1][Tf₂N])、四乙基铵双(三氟甲烷磺酰)亚胺盐([N2,2,2,2][Tf₂N])、四丙基铵双(三氟甲烷磺酰)亚胺盐([N3,3,3,3][Tf₂N])、四丁基铵双(三氟甲烷磺酰)亚胺盐([N4,4,4,4][Tf₂N])。

进一步，所述底物的优选浓度为1200mM。

进一步，所述离子液体为四甲基铵半胱氨酸，四乙基铵半胱氨酸，四甲基铵谷氨酸或四乙基铵谷氨酸。

进一步，所述分离纯化的方法为：反应结束后，将反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，离心收集乙酸乙酯层，将乙酸乙酯层减压浓缩至无液体流出，获得浓缩液，将浓缩液进行硅胶柱层析，以体积比8:1的石油醚和乙酸乙酯混合液为洗脱剂进行洗脱，TLC跟踪，收集R_f值为0.3～0.6的洗脱液，减压浓缩至干，即得产物。

本发明中所述的产物产率和产物ee值测定采用气相色谱法。

气相色谱的检测条件为：日本岛津GC-2014气相色谱仪，N2000色谱工作站，美国Chirasil-Dex CB毛细管柱。载气为氮气；流速为2mL/min；进样量：1μL；分流比为15:1；检测器为氢火焰离子检测器；进样口温度和检测器温度为250℃；柱温为程序升温：80℃保留2min，然后以8℃/min升温至150℃，保留5min。

产率计算方法为：

内标法：以十二烷为内标物，测得产物浓度标准曲线。测定时在样品中加入一定量的十二烷为内标物，根据内标物浓度计算得出产物浓度。

产物的产率由下述公式计算获得：

式中C₀、C_产物分别为反应起始时底物的摩尔浓度和反应结束时产物的摩尔浓度。

产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess,ee)来表征。计算公式为：

$>\mathrm{ee}=\frac{C_R-C_S}{C_R+C_S}\times 100\%$>

式中C_R和C_S分别为R型和S型3,5-双三氟甲基苯乙醇的摩尔浓度。

本发明所述重组基因工程菌是将来源于雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904的短链脱氢酶基因(记为LXCAR，核苷酸序列为SEQ IDNO.1所示，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.2所示)进行突变，通过将SEQ IDNO.2所示氨基酸序列154位的丝氨酸突变为酪氨酸，获得短链脱氢酶突变体(核苷酸序列为SEQ IDNO.3所示，编码蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO.4所示)，继而以短链脱氢酶突变体基因构建的重组表达载体转化宿主菌而获得的，优选重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-LXCAR。雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904短链脱氢酶基因工程菌的构建及表达已在先前的专利申请中公开(申请号2013101896727，公开号CN103421823A)。

本发明所述催化剂按如下方法制备：将含雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904短链脱氢酶突变体基因的重组工程菌接种至含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养，20～37℃、100～200rpm振荡培养6～12h，将培养液以体积比1:100接种至新鲜的含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm振荡培养至培养液的OD₆₀₀达到0.6～0.9时，向培养液中加入终浓度为0.1～1.5mmol/L的IPTG，20～37℃、200rpm继续诱导培养6～12h，将所得培养液离心，收集湿菌体。

本发明的有益效果在于：本发明采用重组基因工程菌不对称还原3,5-双三氟甲基苯乙酮时，在反应体系中加入离子液体，通过改善细胞膜的通透性和对底物的增溶，可有效提高底物的溶解度，并减少底物和产物对反应的抑制作用，从而提高反应的底物浓度和反应效率。反应的底物浓度可由50mM提高到1200mM，且在底物浓度为1200mM时，ee值大于99％，产率由水相还原的70.4％提高到93.8％，产率提高了33.2％。

(四)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904短链脱氢酶突变体的构建

以含雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904源短链脱氢酶的质粒pET28a(+)为模板，经易错PCR、定点突变等方法获得突变体LXCAR，该突变体经测序验证发现，核苷酸序列中的461位的C突变为A，462位的G突变为T；相应的氨基酸序列中的154位的丝氨酸突变为酪氨酸(核苷酸序列为SEQ IDNO.3所示，编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO.4所示)。将获得的短链脱氢酶突变体基因与表达质粒pET28a(+)连接后转入大肠杆菌BL21(DE3)，从而构建获得了含雷弗松氏菌(Leifsoniaxyli)HS0904短链脱氢酶突变体基因的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-LXCAR。

实施例2：本发明实施例所用湿菌体的制备方法

将构建获得的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a(+)-LXCAR接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养12h，再以体积浓度1％的接种量接种到新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至菌体浓度OD₆₀₀为0.6～0.9左右后，向培养液中加入终浓度为0.1mmol/L的异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，置于30℃、200rpm下诱导培养10h。培养结束后，4℃、10000rpm离心10min，收集菌体，用生理盐水洗涤菌体两次，收集湿菌体，即为重组大肠杆菌湿菌体。

实施例3：

分别以含雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904源短链脱氢酶基因的重组工程菌(突变前)和含雷弗松氏菌(Leifsonia xyli)HS0904源短链脱氢酶突变体基因的重组工程菌(突变后)为生物催化剂，进行催化不对称还原3,5-双三氟甲基苯乙酮(BTAP)制备(R)-3,5-双三氟甲基苯乙醇((R)-BTPE)的性能比较。

方法如下(反应体系总体积5mL)：在50mL三角瓶中加入20g/L(湿重)的重组大肠杆菌湿菌体、3.92mL磷酸缓冲液(200mM，pH7.2)、20％(v/v)的异丙醇和200mM的底物(BTAP)。在30℃、200rpm条件下反应4h。反应结束后，反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相用于气相色谱法测定产率和产物ee值。结果表明，突变后的重组工程菌(含短链脱氢酶突变体基因)不对称还原BTAP的产率由突变前(含短链脱氢酶基因)的30.5％提高到70.2％，产物的ee值均大于99％。

实施例4-20：考察不同种类的离子液体对重组基因工程菌不对称还原BTAP制备(R)-BTPE的影响。

方法如下(反应体系总体积5mL)：在50mL三角瓶中加入20g/L(湿重)的重组大肠杆菌湿菌体(实施例2方法制备)、15g/L的不同种类离子液体、3.92mL磷酸缓冲液(200mM，pH7.2)、20％(v/v)的异丙醇和200mM的底物(BTAP)。在30℃、200rpm条件下反应4h。反应结束后，反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相用于气相色谱法测定产率和产物ee值，从而考察不同种类的离子液体对不对称还原制备(R)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的影响，同样条件下以不含离子液体作为对照，结果见表1。

表1

由表1可知，在含不同种类离子液体的缓冲液体系中，重组大肠杆菌均能催化BTAP不对称还原制备(R)-BTPE，且都具有99％以上的ee值，但不同种类的离子液体对还原反应的影响不同。基于氨基酸类的离子液体对还原反应产率的提高具有一定的促进作用，且以离子液体[N1,1,1,1][Cys]为最佳，其产率为89.9％，与不含离子液体的磷酸缓冲液体系(产率为70.1％)相比，提高了28.2％。因此，优选的离子液体确定为四甲基铵半胱氨酸([N1,1,1,1][Cys])。

实施例21-28：

反应体系总体积5mL，在50mL三角瓶中加入20g/L(湿重)的重组大肠杆菌湿菌体(实施例2方法制备)、10～50g/L(10、15、20、25、30、35、40、50g/L)[N1,1,1,1][Cys]、3.92mL磷酸缓冲液(200mM,pH7.2)、20％(v/v)的异丙醇和200mM的底物(BTAP)。在30℃、200rpm条件下反应4h后，反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相用于气相色谱测定产率和产物ee值，从而考察离子液体[N1,1,1,1][Cys]含量对不对称还原制备(R)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的影响，同样条件下以不含离子液体作为对照，结果见表2。

表2

由表2可知，当[N1,1,1,1][Cys]的添加浓度为35g/L时，最大产率为99.1％，比[N1,1,1,1][Cys]的浓度为15g/L时的产率提高了11.1％。且与实施例1([N1,1,1,1][Cys]的添加浓度为0g/L相比，产率提高了41.4％。因此，确定[N1,1,1,1][Cys]的最佳浓度为35g/L。

实施例29～34：

反应体系总体积5mL，在50mL三角瓶中加入20g/L(湿重)的重组大肠杆菌湿菌体(实施例2方法制备)、35g/L N1,1,1,1][Cys]、3.92mL磷酸缓冲液(200mM,pH7.2)、20％(v/v)的异丙醇和200mM的底物(BTAP)。在20℃～45℃、200rpm条件下反应4h后，反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相用于气相色谱测定产率和产物ee值，从而考察反应温度对不对称还原制备(R)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的影响，结果见表3。结果表明，最适的反应温度为30℃。

表3

实施例35～41：

反应体系总体积5mL，在50mL三角瓶中加入20g/L(湿重)的重组大肠杆菌细胞(实施例2方法制备)、35g/L[N1,1,1,1][Cys]、3.92mL pH为6.0～8.0磷酸缓冲液(200mM)、20％(v/v)的异丙醇和200mM的底物(BTAP)。在30℃、200rpm条件下反应4h后，反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相用于气相色谱测定产率和产物ee值，从而考察缓冲液pH值对不对称还原制备(R)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的影响，结果见表4。结果表明，最适的缓冲液pH值为7.0，此时产率由pH值为7.2的98.3％提高到99.8％。

表4

实施例42～48：

反应体系总体积5mL，在50mL三角瓶中加入20g/L(湿重)的重组大肠杆菌细胞(实施例2方法制备)、3.5％(w/v)[N1,1,1,1][Cys]、2.65～4mL磷酸缓冲液(200mM，pH7.0)、20％(v/v)的异丙醇和200～1500mM的底物(BTAP)。在30℃、200rpm条件下反应4h后用等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相用于气相测定产率和产物ee值，从而考察底物浓度对不对称还原制备(R)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的影响，结果见表5。

表5

由表5可知，当底物浓度为1000mM时，产率最大，为42.7％；当底物浓度为1200mM时，产物浓度达到最大，为459.1mM，且产率为38.3％。因此，综合考虑产物浓度和产率，优选底物浓度为1200mM。

实施例49～53：

反应体系总体积5mL，在50mL三角瓶中加入20～200g/L(湿重)的重组大肠杆菌湿菌体(实施例2方法制备)、35g/L[N1,1,1,1][Cys]、3.1mL磷酸缓冲液(200mM，pH7.0)、20％(v/v)的异丙醇和1200mM的底物(BTAP)。在30℃、200rpm条件下分别反应10min后，反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相用于气相分析，测定反应的初速度和产物ee值，从而考察菌体浓度对不对称还原制备(R)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的影响，结果见表6。结果表明，当菌体浓度为50g/L时，反应的初速度最大，为383.6μmol/min/g，因此，优选的菌体浓度为50g/L。

表6

实施例54：

在最优条件下，考察重组工程菌不对称还原制备(R)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的影响。

方法如下(反应体系总体积5mL)：在50mL三角瓶中加入50g/L(湿重)的重组大肠杆菌湿菌体(实施例2方法制备)、3.1mL磷酸缓冲液(200mM，pH7.0)、20％(v/v)的异丙醇、1200mM的底物(BTAP)以及0％[N1,1,1,1][Cys](对照)或35g/L[N1,1,1,1][Cys]，在30℃、200rpm条件下反应12h后用等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯相用于气相测定反应的产率和产物ee值，从而考察重组工程菌在最优的不含离子液体和含离子液体的条件下不对称还原制备(R)-1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]乙醇的结果。

结果表明，在含离子液体[N1,1,1,1][Cys]的缓冲液体系中反应12h后，产物的产率为93.8％，而在不含离子液体[N1,1,1,1][Cys]的缓冲液体系中的产率为70.4％，产率提高了33.2％。

实施例55：产物的分离纯化和鉴定

方法如下：实施例54还原反应结束后，反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，离心收集乙酸乙酯相。将含产物的乙酸乙酯层液体经旋转蒸发器(55℃)真空蒸馏，去掉溶剂乙酸乙酯即得产物的粗提液。将用石油醚浸泡过的硅胶装于层析柱中制备获得硅胶柱，再以石油醚∶乙酸乙酯＝8:1(v/v)的洗脱剂平衡硅胶柱。将获得的产物粗提液上样于硅胶柱上，用石油醚:乙酸乙酯＝8:1(v/v)的洗脱剂进行洗脱分离，用硅胶薄板层析检测所含产物的洗脱液(收集R_f值为0.3～0.6的洗脱液)，合并含产物的洗脱液，经旋转蒸发器真空蒸馏，即得产物。分离获得的产物通过气相色谱检测其纯度，并用CDCl₃溶解后进行¹H和¹³C NMR分析。结果表明，纯化后产物的纯度为99％以上。还原产物用CDCl₃溶解后进行¹H和¹³C NMR检测(谱图见附图2和3)，通过对¹H和¹³C NMR谱图进行分析，得出还原产物为3,5-双(三氟甲基)苯乙醇¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ＝7.82(s,2H),7.77(s,1H),5.02(q,J＝6.8Hz,1H),2.44(s,1H),1.54(d,J＝6.8Hz,3H)。¹³C NMR(100Hz，CDCl₃)δ＝148.2,131.9,131.6,125.6,124.7,122.0,121.3,119.3,69.4,25.7。

实施例56-60：在含离子液体[N1,1,1,1][Cys]的介质中，以其他微生物细胞为生物催化剂，进行3,5-双三氟甲基苯乙酮的不对称还原反应。方法如下(反应体系总体积5mL)：

实施例56：重组工程菌不对称还原3,5-双三氟甲基苯乙酮的反应体系和反应条件同实施例54。

实施例57：雷弗松氏菌(L.xyli)HS0904反应体系为：20％(v/v)异丙醇、300g/L菌体，3,5-双三氟甲基苯乙酮200mM，3.92mL磷酸缓冲液(200mM，pH8.0)，离子液体35g/L，其他操作同实施例54。雷弗松氏菌(L.xyli)HS0904的来源和湿菌体的制备方法见已申请的专利(CN102102087A，20110622)。

实施例58：棘孢木霉(T.asperellum)ZJPH0810反应体系为：800g/L菌体，6.0％(体积浓度)乙醇，0.5％甘油，3,5-双三氟甲基苯乙酮100mM，4.6mL蒸馏水，离子液体35g/L，其他操作同实施例54。棘孢木霉(T.asperellum)ZJPH0810的来源和湿菌体的制备方法见已申请的专利(CN101724568A，20110831)。

实施例59：热带假丝酵母(C.tropicalis)104反应体系为：50g/L麦芽糖，300g/L菌体，3,5-双三氟甲基苯乙酮50mM，4.95mL磷酸缓冲液(200mM，pH8.0)，离子液体35g/L，其他操作同实施例54。热带假丝酵母(C.tropicalis)104的来源和湿菌体的制备方法见已申请的专利(CN101519674A，20090902)。

实施例60：红串红球菌(R.erythropolis)XS1012反应体系为：50g/L葡萄糖，10％(体积浓度)异丙醇，200g/L菌体量，3,5-双三氟甲基苯乙酮30mM，4.47mL磷酸缓冲液(200mM，pH7.0)，离子液体35g/L，其他操作同实施例54。红串红球菌(R.erythropolis)XS1012的来源和湿菌体的制备方法见已申请的专利(CN103773724A，20140507)。

反应条件均为30℃，200rpm。结果见表7。

表7

由表7可知，离子液体[N1,1,1,1][Cys]对不同菌株催化还原3,5-双三氟甲基苯乙酮的影响并不相同。离子液体[N1,1,1,1][Cys]能显著提高本申请述及重组工程菌和棘孢木霉(T.asperellum)ZJPH0810不对称还原3,5-双三氟甲基苯乙酮的催化效率，产率分别提高了33.2％和20.3％；而采用雷弗松氏菌(L.xyli)HS0904作为催化剂时，产率无明显提高，仅将反应时间缩短了6h；当以热带假丝酵母(C.tropicalis)104作为催化剂时，产率提高了8.6％；而在含[N1,1,1,1][Cys]的反应介质中红串红球菌(R.erythropolis)XS1012催化不对称还原3,5-双三氟甲基苯乙酮的产率则下降了19.8％。