一种快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法和试剂盒

摘要

本发明公开一种快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法和试剂盒。该方法通过以待检样品的基因组DNA为模板，在qPCR反应体系中还加入如SEQ ID NO.1、2、4和5所示的引物和如SEQ ID NO.3和6所示的探针进行双重实时荧光定量PCR，Ct值40为阴性。实现该方法的试剂盒主要包括上述引物和探针。本发明具有如下优点：能极大地缩短检测时间，只需要1天时间即可完成整个检测；操作更加简单，只需要提取核酸和荧光PCR，无需额外操作；一次性能对待检样品进行胎儿弯曲菌和性病亚种的定性和定量检测；灵敏度高，结果准确可靠。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种 的方法和试剂盒。

背景技术

胎儿弯曲菌是一类革兰染色阴性、氧化酶阳性、触媒阳性、呈逗点或S形 弯曲、动力活泼、嗜微需氧菌的人兽共患传染病病原体。胎儿弯曲菌常定居在 野生动物、家禽、家畜及宠物的肠道或泌尿生殖道内，通过“粪-口”途径的方 式感染人类，常导致人类肠外感染，如菌血症、脑膜炎、关节炎、蜂窝组织炎、 动脉瘤感染等疾病。胎儿弯曲菌可分为胎儿亚种和性病亚种，性病亚种常存在 于动物生殖道中，通过交配和人工授精等传播，常导致牛羊不育、流产和生殖 道炎症。目前，胎儿弯曲菌国内有《GB/T18653-2002》对绵羊、牛的冷冻精液 中胎儿弯曲菌的标准检验方法，这种方法仅适用于液体样品，对固体样品具有 一定局限性；同时，弯曲菌培养条件苛刻、生长缓慢，从培养到生化鉴定需要7～ 9天，会延误相应的诊断和治疗；再者，弯曲菌培养操作繁琐，需要微需氧环境， 培养到生化鉴定需要8种培养基，进行10次试验。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种快速鉴别胎 儿弯曲菌和性病亚种的方法。

本发明的另一目的在于提供实现上述方法的试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚 种的方法，包括如下步骤：

(1)设计双重实时荧光定量PCR的引物和探针：

①胎儿弯曲菌的检测引物和探针：

Sap-F：5’-GGTGGAGAATTTACTGATAG-3’；

Sap-R：5’-GCCTTAGCCTCAAATATAG-3’；

Sap-P：5’-FAM-TTAGACTCAGCACTACCGCCATT-BHQ1-3’；

②胎儿弯曲菌性病亚种检测引物：

Par-F：5’-GTGGATCGGCATCTACTA-3’；

Par-R：5’-ATCGCAATCTGCAATGAA-3’；

Par-P：5’-HEX-TATCATCGCCGACGAGTGCC-BHQ1-3’；

(2)提取待检样品中的基因组DNA；

(3)以步骤(2)得到的基因组DNA为模板，加入步骤(1)的引物和探 针，进行双重实时荧光定量PCR；

(4)结果判断：Ct值<35为阳性；35～40为可疑，需要重复试验一次；>40 为阴性；

步骤(2)中所述的待检样品包括粪便、生殖道涂抹物和血液；

步骤(2)中所述的待检样品可通过常规方法得到基因组DNA，如通过相应 的基因组试剂盒提取基因组DNA；

步骤(2)中所述的待检样品优选经过增菌，再进行基因组DNA的提取；

步骤(3)中所述的双重实时荧光定量PCR的体系优化为：qPCR MIX(2.5 ×)10μL、引物Sap-F(10nM)1.25μL、引物Sap-R(10nM)1.25μL、引物Par-F (10nM)1.25μL、引物Par-R(10nM)1.25μL、探针Sap-P(10nM)0.5μL、探 针Par-P(10nM)0.5μL、Enchancer Solution(增强剂，20×)1.25μL、模板DNA 5μL，无菌水补足至25μL；

步骤(3)中所述的双重实时荧光定量PCR的条件优选为：95℃2min；95 ℃10s、56℃30s，40个循环；在退火阶段接受荧光信号；

步骤(4)中所述的阳性的解读如下：只出现sap扩增产物，表示待检样品 含有胎儿弯曲菌胎儿亚种；若同时出现sap扩增产物和par扩增产物，比较FAM 曲线和HEX曲线的ct值，若两者ct值相同时，待检样品只含胎儿弯曲菌性病 亚种，若两者ct值不同时，待检样品含有胎儿弯曲菌胎儿亚种和性病亚种；

实现上述快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法的试剂盒，包括如下引物 和探针：

Sap-F：5’-GGTGGAGAATTTACTGATAG-3’；

Sap-R：5’-GCCTTAGCCTCAAATATAG-3’；

Sap-P：5’-FAM-TTAGACTCAGCACTACCGCCATT-BHQ1-3’；

Par-F：5’-GTGGATCGGCATCTACTA-3’；

Par-R：5’-ATCGCAATCTGCAATGAA-3’；

Par-P：5’-HEX-TATCATCGCCGACGAGTGCC-BHQ1-3’；

所述的试剂盒还包括阳性对照；

所述的阳性对照为胎儿弯曲菌的Sap基因或含有胎儿弯曲菌Sap基因的核 酸序列；以及胎儿弯曲菌性病亚种的Par基因或含有胎儿弯曲菌性病亚种Par基 因的核酸序列；

所述含有胎儿弯曲菌Sap基因的核酸序列优选为将胎儿弯曲菌Sap基因和 克隆载体重组得到的质粒；

所述含有胎儿弯曲菌性病亚种Par基因的核酸序列优选为将胎儿弯曲菌性 病亚种Par基因和克隆载体重组得到的质粒；

所述的试剂盒还含有qPCR所用的酶、缓冲液和增强剂等。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供的方法和试剂盒，能极大地缩短检测时间，只需要1天时 间即可完成整个检测。

(2)操作更加简单，只需要提取核酸和荧光PCR，无需额外操作。

(3)一次性能对待检样品进行胎儿弯曲菌和性病亚种的定性和定量检测。

(4)灵敏度高，结果准确可靠。

附图说明

图1是Sap-阳性克隆标准曲线图。

图2是Par-阳性克隆标准曲线图。

图3是Sap-阳性克隆的灵敏度检测结果图。

图4是Par-阳性克隆的灵敏度检测结果图。

图5是特异性实验扩增曲线图；其中，曲线1是胎儿弯曲菌胎儿亚种 ATCC27374，曲线2是胎儿弯曲菌性病亚种ATCC19438，曲线3是胎儿弯曲菌 性病亚种ATCC19438。

图6是对比例1的扩增曲线图。

图7是对比例2的扩增曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。

实施例1：

(1)设计双重实时荧光定量PCR的引物和探针：

①胎儿弯曲菌的检测引物和探针：

Sap-F：5’-GGTGGAGAATTTACTGATAG-3’；

Sap-R：5’-GCCTTAGCCTCAAATATAG-3’；

Sap-P：5’-FAM-TTAGACTCAGCACTACCGCCATT-BHQ1-3’；

以胎儿弯曲菌为模板，通过引物Sap-F和Sap-R扩增得到的产物的长度为 137bp；Sap-P为Taqman探针。

②胎儿弯曲菌性病亚种检测引物：

Par-F：5’-GTGGATCGGCATCTACTA-3’；

Par-R：5’-ATCGCAATCTGCAATGAA-3’；

Par-P：5’-HEX-TATCATCGCCGACGAGTGCC-BHQ1-3’；

以胎儿弯曲菌性病亚种为模板，通过引物Par-F和Par-R扩增得到的产物的 长度为112bp；Par-P为Taqman探针。

(2)阳性质粒的制备

1)通过细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)，按说明 书的操作，分别抽提胎儿弯曲菌(ATCC27374)和胎儿弯曲菌性病亚种(ATCC 19438)的基因组DNA。

2)以Sap-F和Sap-R为引物对，以胎儿弯曲菌(ATCC27374)的基因组DNA 为模板进行PCR；以Par-F和Par-R为引物对，以胎儿弯曲菌性病亚种(ATCC 19438)的基因组DNA为模板进行PCR。PCR扩增条件为：预变性95℃5min； 变性95℃20sec、退火55℃30sec、延伸72℃1min，30个循环；终延伸72℃5min。 PCR扩增体系为：基因组DNA 2μL、引物对(浓度分别为10μmol/L)各1μL、 PCR MIX(天根生化科技公司)25μL，双蒸水补足至50μL。将得到的PCR产物 通过2％的琼脂糖凝胶电泳(100V，70min)分离，通过DNA凝胶回收试剂盒 (Invitrogen Purelink^@Quick Gel Extraction Kit)回收，分别得到Sap片段(137bp) 和Par片段(112bp)。

3)将步骤2)得到的Sap片段(137bp)和Par片段(112bp)分别末端平端 化，再与平末端载体连接，具体如下：目的片段(Sap片段或Par片段)3μL，2 ×ReactionBuffer 5μL，DNA平端化酶0.5μL，加水补足8.5μL；70℃反应5min， 放在冰上冷却，再加入pZeroBack/blunt载体(2974bp，天根生化科技公司)1μL 和T4连接酶(天根生化科技公司)0.5μL，于22℃反应5min。反应结束后，置 于冰上。

4)将步骤3)得到的连接产物分别转化大肠杆菌TOP10感受态细胞(天根 生化科技公司)中，将转化液涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，得到 初步筛选得到的克隆；接着通过菌落PCR对初步筛选得到的克隆进行复筛，反应 条件同步骤2)；将复筛阳性的克隆扩大培养并提取质粒，经上海美吉生物(广州) 公司测序确定，分别得到Sap-阳性克隆和Par-阳性克隆。

Sap-阳性克隆含如下序列(划横线部分为目的序列)：

GCGAACTCGATGGCTCGAGTTTTAGCAGATGGTGGAGAATTTACTGATAGTAAGGGTAATGTTATTAATGTTGCTAGTTTAAGCAAGGGTGATTTAATAGGTGCTATGATTGACTCTATGGTTAATGGTGGTAGTGCTGAGTCTAAGGCTATATTTGAGGCTAAGGCATCTTTCTAGAAGATCTCCTACAATATTCTCAGCTGCCATGGAAAATCGATGTTCTTAAAAT；

Par-阳性克隆含如下序列(划横线部分为目的序列)：

CGTATTGTAGAGACTTCTAGATGATGTGGATCGGCATCTACTAAAAGCGTATCATCGCCGACGAGTGCCAGCTTTATGGCTAAATTTATGGCGATATTTGTTTTGCCGCTACCGCCTTTTTCATTGCAGATTGCGATATCTTGCTGAAAAACTCGAGC CATCCGGAAGATCTGGCGGCCGCTCTCCCTATAGTGAGTCGA。

经Blast证实：重组的碱基没有变异和缺失。

(3)标准曲线的绘制

1)使用质粒抽提试剂盒抽提得到Sap-阳性克隆质粒(3111bp)和Par-阳性克 隆质粒(3086bp)。经Eppendorf核酸蛋白分析仪检测，Sap-阳性克隆质粒和Par- 阳性克隆质粒溶液在260nm的吸光度值分别为0.0228ng/L、0.0317ng/L；经如下 公式计算其相应的质粒拷贝浓度为3.3×10¹⁰拷贝/μL，4.7×10¹⁰拷贝/μL。

阿伏伽德罗常数＝6.02×10²³,重组质粒碱基数＝质粒大小+重组片段大小

2)质粒稀释

将两种质粒用Easy Dilution稀释液分别十倍稀释，使其终浓度从10⁹～10⁰级 共十个稀释梯度，如表1所示：

表1.质粒稀释浓度表

*：Sap-阳性克隆质粒为3.3；Par-阳性克隆质粒为4.7。

3)取各浓度梯度质粒溶液2μL，进行荧光PCR扩增，扩增后根据Ct值和样 品浓度自动生成标线，并得出相关系数R²。根据公式E＝10^-1/SLOPE-1，带入扩增 sap和par的标准曲线斜率，分别计算其各自标准曲线的扩增效率。

经优化后的反应体系为：取模板(质粒)5μL、qPCR MIX(Tiangen公司) 10μL、enhancer Solution 1.25μL、引物Sap-F(10nM)1.25μL、引物Sap-R(10nM) 1.25μL、引物Par-F(10nM)1.25μL、引物Par-R(10nM)1.25μL、探针Sap-P(10nM) 0.5μL、探针Par-P(10nM)0.5μL、加水补至体系25μL。

经优化后的反应条件为：预变性95℃2分钟；变性95℃10秒、退火温度56℃ 30秒，40个循环，在退火阶段采集荧光信号。

仪器设置为：在applied system 7500fast上Sap探针的报告基团选择FAM、 淬灭基团选择BHQ；Par基因的报告基团选择HEX，淬灭基团选择BHQ；参比 荧光(passive reference)选择ROX。

A、Sap-阳性克隆质粒的标准曲线

曲线结果如图1所示，X轴为质粒拷贝浓度的对数值，Y轴为对应的Ct值， 线性方程为Y＝-3.3382X+40.0153，相关系数为99.91％，扩增效率为99.33％。

B、Par-阳性克隆质粒的标准曲线

曲线结果如图2所示，X轴为质粒拷贝浓度的对数值，Y轴为对应的Ct值， 线性方程为Y＝-3.3694X+41.3279，相关系数为99.91％，扩增效率为98.06％。

(4)荧光PCR检测其灵敏度

分别取10个梯度(10⁹～10⁰copies/μL)的质粒标准品2μL，分别用同步骤(3) 3)进行荧光PCR扩增，观察扩增曲线及Ct值。

A.双重荧光PCR的Sap-阳性克隆质粒标准品灵敏度检测结果

如图3所示，其对应的Ct值分别为10.01，12.93，16.94，20.04，23.53，26.58， 29.87，34.77和und。因此该方法对Sap-阳性克隆质粒的灵敏度为Ct值为34.77， 对应模板浓度3.3×10²copies/μL。

B.双重荧光PCR的Par-阳性克隆质粒标准品灵敏度检测结果

如图4所示，其对应的Ct值为11.01，14.04，18.00，21.08，24.63，27.90， 31.50，34.22和und。因此该方法对Par-阳性克隆质粒的灵敏度为Ct值为34.22， 对应的模板浓度4.7×10²copies/μL。

(5)特异性检验

.菌株：标准菌株(如表2所示)：胎儿弯曲菌胎儿亚种1株，胎儿弯曲菌性 病亚种1株，弯曲菌属其他菌种2株，其他肠道致病菌和微需氧菌标准株21株。

表2标准菌株

将上述菌株用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，分别用步骤(3)3) 的反应体系和反应条件，用Taqman双探针荧光PCR方法进行检测，结果如图5 所示，以胎儿弯曲菌胎儿亚种的基因组DNA为模板，出现一条曲线，以胎儿弯 曲菌性病亚种的基因组DNA为模板，出现两条曲线。从图5中可见，sap基因能 特异扩增胎儿弯曲菌胎儿亚种和性病亚种，par基因能特异扩增性病亚种；其他 对照菌株和NTC均无扩增信号。

(6)实际应用

I、提取样品的基因组DNA

①25份粪便和13份生殖道拭子样本使用Tiangen粪便基因组DNA提取试剂 盒，按说明书步骤进行提取。

②107份血液样本使用Tiangen细菌基因组提取试剂盒，按说明书步骤进行 提取。

II、双重荧光定量PCR

反应体系为：取模板(基因组DNA)5μL、qPCR MIX(Tiangen公司)10μL、 enhancer Solution 1.25μL、引物Sap-F(10nM)1.25μL、引物Sap-R(10nM)1.25μL、 引物Par-F(10nM)1.25μL、引物Par-R(10nM)1.25μL、探针Sap-P(10nM) 0.5μL、探针Par-P(10nM)0.5μL、加水补至体系25μL。

反应条件为：预变性95℃2分钟；变性95℃10秒、退火温度56℃30秒， 40个循环，在退火阶段采集荧光信号。

仪器设置为：在applied system 7500fast上Sap探针的报告基团选择FAM、 淬灭基团选择BHQ；Par基因的报告基团选择HEX，淬灭基团选择BHQ；参比 荧光(passive reference)选择ROX。

III、结果判断，如表3所示：

表3Ct值＜35为阳性，35～40为可疑，需要重复试验一次，＞40为阴性。

注：荧光PCR结果中9个样品均只有一条FAM扩增曲线，为胎儿弯曲菌胎儿亚种

该方法与生化培养方法完全一致，从而证明本发明提供的双重荧光PCR准确 性高，而且所用的时间较生化培养方法所需时间大大缩短，只需要一天时间。

IV、生化培养方法如下：

①将步骤I中的样品进行增菌培养

粪便：取1g粪便到10mL的bolton肉汤；

生殖道涂抹物：将棉拭子放入10mLbolton肉汤，置于微需氧(5％O2、10％CO2、 85％NO2)环境，37℃培养2天，取一环增菌液划线接种于skirrow平板，微需氧 条件下培养2天，调取灰白、圆形凸起、湿润有光泽的小菌落经血平板纯培养后 用API Campy鉴定；

血液：用注射器吸取0.5ml血液到血平板上，置于微需氧(5％O₂、10％CO₂、 85％NO₂)环境，37℃培养2天，调取灰白、中等大小、圆形凸起、边缘整齐的 菌落，经血平板纯培养后用API Campy鉴定。

②革兰染色，按常规方法进行革兰氏染色。

③氧化酶和触媒试验

④API Campy鉴定，按API试纸条的操作说明进行实验。

生化培养的结果和双重荧光PCR的结果是一致的。生化培养的结果需7～10 天才能确定。

对比例1

(1)依据文献“Evaluation of molecular assays for identification Campylobacter  fetus species and subspecies and development of a C.fetus specific real-time PCR  assay，Journal of Microbiology Methods，2013”的报道，通过引物合成，得到如 下引物和探针，重复前述文献的实验过程：

nahE-f：5’-TGTTATGGTGATC AAAATAGCTGTTG-3’；

nahE-r：5’-GAGCTGTTTTTATG-3’；

nahE-p：5’-FAM-TGTATATGCACTTTTAGCAACTT-BHQ1-3’。

(2)反应体系和条件

反应体系为：qPCR MIX(2.5×)10μL、Enhancer solution(20×)1.25μL、 引物nahE-f(10nM)1.25μL、引物nahE-r(10nM)1.25μL、探针nahE-p(10nM) 0.5μL、DNA模板2μL、无菌超纯水补足25μL。

反应条件：扩增参数：95℃1min；95℃10s、56℃30s，40循环。

(3)DNA模板

1)胎儿弯曲菌胎儿亚种ATCC27374；2)胎儿弯曲菌性病亚种ATCC19438； 3)大肠弯曲菌ATCC33559；4)空肠弯曲菌ATCC29428；5)阴性对照。

4.实验结果：

无法重复上述文献的实验结果，即不能够检测胎儿弯曲菌。如图6所示，使 用上述的引物和探针，只有胎儿弯曲菌性病亚种ATCC19438有荧光信号，而胎 儿弯曲菌胎儿亚种ATCC27374无荧光信号。

对比例2

(1)根据2009年11月《中国预防兽医学报》杂志中的关于胎儿弯曲菌检测 的《胎儿弯杆菌病Taqman实时荧光定量PCR检测方法的建立》中提供的可用以 检测胎儿弯曲菌的一对引物和探针：

CF-sapAF：5’-CCTTAGCTCTTCTGCGTTTA-3’；

CF-sapAR：5’-AGCGCTGTTACATCATTTAGTT-3’；

CF-sapP：5’-FAM-CTAAAGAGGCTGCCGATACGACT-TAMRA-3’。

(2)反应体系和条件

反应体系为：qPCR MIX(2.5×)10μL、Enhancer solution(20×)1.25μL、 引物CF-sapAF(10nM)0.5μL、引物CF-sapAR(10nM)0.5μL、探针CF-sapP(10nM) 0.5μL、DNA模板1μL、无菌超纯水补足25μL。

反应条件：扩增参数：95℃1min；95℃10s，60℃45s，40循环。

(3)DNA模板

1)胎儿弯曲菌胎儿亚种ATCC27374；2)胎儿弯曲菌性病亚种ATCC19438； 3)大肠弯曲菌ATCC33559；4)空肠弯曲菌ATCC29428；5)阴性对照。

(4)实验结果

重复了3次，均无法重复该文的实验结果，即未能够检测胎儿弯曲菌。胎儿 弯曲菌胎儿亚种ATCC27374和性病亚种ATCC19438均无荧光信号(见图7)。

对比例3

(1)dam基因作为胎儿弯曲菌扩增的目的基因，parC作为性病亚种扩增的 目的基因，设计的引物和探针为：

damF：5’-GCATGAAAATCTAGCCAAA-3’；

damR：5’-GCTCTTTGAATTTGAAATCC-3’；

damp：5’-FAM-ACTTCTAACCATCTCACAGTCGTTG-BHQ1-3’；

parcF：5’-GGTTGAAAACTAAAATCATCTTA-3’；

parcR：5’-CGTGATAGCCAAGAAATG-3’；

parcP：5’-HEX-TTAATACCGCAATATCAAGATCGCTT-BHQ1-3’；

以胎儿弯曲菌胎儿亚种ATCC27374和性病亚种ATCC19438的基因组DNA 分别为模板，使用本对比例中的引物和探针，参照同实施例1的扩增体系和条件 进行荧光定量PCR。经扩增后，胎儿弯曲菌胎儿亚种ATCC27374和性病亚种 ATCC19438均无荧光增长信号；

(2)sapA12基因作为胎儿弯曲菌扩增的目的基因，parA作为性病亚种扩增 的目的基因，设计的引物和探针为：

sapF：5’-GGCCTTTGAAGTTATTCTTC-3’；

sapR：5’-CTGAGGGTGGAGATCTTA-3’；

sapP：5’-FAM-AAGCACATCATTACCAGCACCAC-BHQ1-3’；

paraF：5’-TGGCAATATCGCAAACTG-3’；

paraR：5’-CTGCTATTTAATAGTGTCTCAAAG-3’；

paraP：5’-HEX-TTCTTGGCTATCACGTCCGC-BHQ1-3’；

以胎儿弯曲菌胎儿亚种ATCC27374和性病亚种ATCC19438的基因组DNA 分别为模板，使用本对比例中的引物和探针，参照同实施例1的扩增体系和条件 进行荧光定量PCR。经扩增后，胎儿弯曲菌胎儿亚种ATCC2737无荧光增长信号， 性病亚种ATCC19438有荧光增长信号。

可见，多重荧光PCR检测胎儿弯曲菌并不是一件容易的事。多重荧光PCR 的难点在于：A、扩增靶基因的选择，因为靶基因需要满足保守和特异，因此需 要对靶基因进行反复选择和试验；B、由于存在两对引物和两条探针，首先两两 引物之间、探针之间不能相互配对，否则易形成二聚体；C、PCR扩增产物的长 度在100-150bp之间；D、对引物和探针的浓度组合优化，选取某一浓度组合时， CT值最小扩增信号最强；E、对退火温度优化，某一退火温度时，扩增曲线较 好、产物量较高且无非特异性产物；F、探针设计有一系列要求：tm值比引物tm 值高5-10℃，5’端不能为G，位置尽可能靠近上游引物，长度在20-30bp，碱 基C含量要高于G含量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。