基于18S rRNA基因的猪旋毛虫检测试剂盒及应用

摘要

本发明提供一种基于18SrRNA基因的猪旋毛虫检测试剂盒，由无菌去离子水、PCR反应液、TaqDNA聚合酶、GoldViewDNA染料、溴酚蓝上样缓冲液、标准品、对照品组成。本发明试剂盒即可快速、准确地检测出被检标本中的猪旋毛虫DNA，也可用于猪旋毛虫感染的分子流行病学调查及疗效监测。本试剂盒操作步骤简单费用低，尤其是用于大量样品的大规模检测时，不仅省时省力而且节省了大量的试剂和耗材，提高了工作效率。本方法是建立在分子生物学基础上的一种敏感性高、特异性强的检测方法，大大提高了检测准确率，降低了假阳性率，可在检测猪旋毛虫中的应用。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术，尤其涉及一种检测猪旋毛虫这种食源性寄生虫的试剂盒，可在鉴别检测感染猪旋毛虫的标本中应用。

背景技术

旋毛虫病是一种严重危害公共卫生安全的人畜共患病，它是由旋毛虫(Trichinella>)成虫寄生于哺乳动物肠道以及幼虫寄生于肌肉组织所引起的疾病。

旋毛虫病呈世界性分布，其中不乏发达国家，而我国是世界上旋毛虫危害最为严重的几个国家之一。旋毛虫可感染的宿主范围很广泛，对人和动物均有明显的致病性，家畜中除猫和犬等肉食动物之外，猪患病率最高。旋毛虫感染后可在宿主体内常年寄生，被感染动物终生带虫。但患病猪往往没有临床症状，人类因生食半熟或生的含有旋毛虫的猪肉而感染，常常出现胃肠道症状、发热、水肿、血液嗜酸粒细胞增多、原因不明的常年肌肉酸痛等的病征，重者丧失劳动能力，甚至死亡。由于旋毛虫病的临床表现较为复杂，特别在感染早期或轻度感染时动物临床症状不典型，常引起忽视或误诊，从而延误救治时机而引起重大损失，所以准确诊断旋毛虫病并及时治疗是控制该病比较有效的方法。因此，要控制旋毛虫病的流行必须首先从源头抓起，严格控制食源性寄生虫病在畜禽中流行，把好屠宰检疫关。

然而，目前食品安全卫生问题非常严峻，但屠宰检疫技术却相当落后。屠宰动物旋毛虫病的检测仍采用约180年前发现该寄生虫时的显微镜镜检法，极易造成漏检。这严重影响了肉品质量，同时也给消费者的健康造成巨大威胁。因此，对建立一种操作简单、快速、敏感、特异的检测猪旋毛虫方法势在必行。PCR方法是一种操作简单、敏感性高、特异性强的分子生物学检测方法，它可以在一个反应体系中扩增DNA样本的目的基因片段，特别适用于感染的大量临床样本的快速诊断。因此，建立旋毛虫PCR快速检测方法，可为临床上防治该病的提供科学依据，而且对提高动物疫病的检测、监控水平，保障动物源性食品安全具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于18S rRNA基因的猪旋毛虫检测试剂盒，该试剂盒包含：无菌去离子水、PCR反应液、Taq>

其中，PCR反应液由PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、检测用引物组成，检测用引物分别为检测猪旋毛虫的上游引物和下游引物共2条：

猪旋毛虫上游引物（SEQ ID No：1）：5’-CATTCGTGGTTGCTGTTGTTGC-3’，

猪旋毛虫下游引物（SEQ ID No：2）：5’-CGTTGACGCTTTCATTGTAG-3’，

标准品为具有猪旋毛虫（Trichinella>）的重组质粒，其核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。

对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为有猪旋毛虫DNA片段的DNA样品，阴性对照为无猪旋毛虫DNA的DNA样品。

本试剂盒保存于-20 ℃，尽量减少反复冻融。

本发明另一个目的是提供所述试剂盒在检测猪旋毛虫这种食源性寄生虫中的应用。

本发明试剂盒使用方法：

每次检测均应设立阳性对照和阴性对照。标准品用无菌去离子水稀释为60 ng/μl。

1. PCR反应管制备：总体积为25 μl，PCR反应液于冰上融化及制备PCR反应管。依次取PCR反应液22.8 μl，Taq>

2. 扩增检测：把PCR反应管置于PCR仪上，设置反应条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s、60 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s共 30个循环，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

3. 检测结果判定：将1 g琼脂糖溶于100 ml 的0.5×TBE电泳缓冲液中，然后加入5μl GoldView DNA染料，混匀后煮沸，倾倒凝胶板。凝胶冷却凝固后，将PCR产物8 μl与适量上样缓冲液混合，加入凝胶孔中进行电泳。电泳结束后取出凝胶置于紫外灯下观察、拍照。标准品孔和阳性对照孔均有目的条带而阴性对照孔无任何条带说明PCR反应检测成功。被检样本孔出现的电泳条带与标准品孔、阳性对照孔相应条带大小一致则判定为阳性，反之则为阴性。

本发明的优点：本发明提供了一种猪旋毛虫单重PCR检测试剂盒，其优点是一个反应即可快速、准确地检测出被检标本中的猪旋毛虫DNA，也可用于猪旋毛虫感染的分子流行病学调查及疗效监测。本方法的模板DNA制备步骤简单费用低，尤其是用于大量样品的大规模检测时，不仅省时省力而且节省了大量的试剂和耗材，提高了工作效率。本方法是建立在分子生物学基础上的一种敏感性高、特异性强的检测方法，大大提高了检测准确率，降低了假阳性率。

附图说明

图1 猪旋毛虫标准品的PCR产物电泳结果。

图2 猪旋毛虫阳性样本的PCR检测结果。

图3 本发明对采集的部分标本检测结果。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。

实施例一

本发明提供一种基于18S rRNA基因的猪旋毛虫PCR检测试剂盒，该试剂盒包含：无菌去离子水、PCR反应液、Taq>

其中，PCR反应液由PCR缓冲液、MgCl₂、dNTPs、检测用引物组成，检测用引物分别为检测猪旋毛虫的上游引物和下游引物共2条（表1）。

标准品为具有猪旋毛虫（Trichinella>）的重组质粒，其核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。

对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阳性对照为有猪旋毛虫DNA片段的DNA样品，阴性对照为无猪旋毛虫DNA的DNA样品。本试剂盒保存于-20 ℃，尽量减少反复冻融。

实施例二猪旋毛虫标准品的PCR检测

1. 材料

Taq>

2. 引物设计与合成（表2）。

以上述虫种目的基因序列为模板，使用Primer Premier 5.0软件进行分析、设计引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

3. 检测标准品制备

分别取猪旋毛虫的虫体，根据通用基因组提取试剂盒说明书提取基因组DNA作为模板，用相应虫体的标准品上下游引物在PCR仪上进行扩增，反应条件为95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s、60 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s共 30个循环，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR产物经1%琼脂糖电泳确认条带大小正确之后切下目的条带进行凝胶回收。回收产物用克隆系统插入pMD18-T载体，并转化入大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基中培养，将阳性克隆送杭州华大基因研发中心进行测序验证。测序表明插入片段正确的相应凝胶回收产物用无菌去离子水调整为60 ng/μl即为标准品。

4. 结果

经测序表明，上述设计标准品完全与预期符合，猪旋毛虫标准品目的基因序列分别如序列表的SEQ ID No：3。PCR结果参见图1：M，DNA分子量标准marker；1：猪旋毛虫单重PCR标准品条带；2：阴性对照品。

实施例三>

1. 标本DNA提取

分别采集4例经传统方法确诊的猪旋毛虫阳性猪肝脏标本9 克，按通用基因组DNA提取试剂盒说明书提取DNA，用无菌去离子水调整DNA浓度为60 ng/μl。

2. 标本检测

取出PCR反应液于冰浴融化后取22.8 μl，加入DNA聚合酶0.2 μl，再加入待检标本DNA 2 μl即可。另外同时再设置3个PCR反应管，依次加入上述试剂，但DNA分别用标准品、阳性对照品、阴性对照品代替。制备好的PCR反应试剂管用微量移液器吹打混匀后瞬时高速离心2 s，置于PCR仪上后运行如下反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s、60 ℃退火45 s、72 ℃延伸60 s共 30个循环，72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。

3. 检测结果

检测结果参见图2，图中S：标准品对照；P：阳性对照；N：阴性对照；1：猪旋毛虫阳性。

实施例四猪旋毛虫检测试剂盒的应用

方法同实施例三，随机采集猪肝脏标本，提取DNA，PCR扩增，结果参见图3：最左边两泳道“P、N”分别为阳性对照和阴性对照；3、11与18泳道为猪旋毛虫阳性；其余泳道均为阴性。

本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

<110>浙江大学

<120>基于18S rRNA基因的猪旋毛虫检测试剂盒及应用

<160>3

<170>DNAStar5.0

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>猪旋毛虫（Trichinella spiralis）

<220>

<221>RRNA

<400>1

cattcgtggt tgctgttgtt gc 22

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>猪旋毛虫（Trichinella spiralis）

<220>

<221>RRNA

<400>2

cgttgacgct ttcattgtag 20

<210>3

<211>798

<212>DNA

<213>猪旋毛虫（Trichinella spiralis）

<220>

<221>RRNA

<400>3

cattcgtggt tgctgttgtt gctcttcatt gagtgtcaat ggtgcctcga gattttactt 60

tgaaaaaatt agagtgctca aagcaggttg tgatgcctga ataatggtgc atggaataat 120

agaatacgat ctcggttcta ttttgttggt tttcgaaccg gagataagta ttgaaaggaa 180

cagacggggg cattcgtatt gctgcgttag aggtgaaatt cttggatcgc agcaagatga 240

acaattgcga aagcatttgc caagaatgtt ttcattaatc aagaacgaaa gttagaggtt 300

cgaaggcgat cagataccgc cctagttcta acggtaaact atgccaacca gcgattcgcc 360

gaagttcatt taagactcgg cgagcagctt ccgggaaacc aaagtgtttc ggttccgggg 420

gaagtatggt tgcaaagctg aaacttaaag gaattgacgg aagggcacca ccaggagtgg 480

agcctgcggc ttaatttgac tcaacacggg aaaactcacc cggcccggac actggaagga 540

ttgacagatt gacagctctt tcttgattca gtgggtagtg gtgcatggcc gttcttagtt 600

ggtggagcga tttgtctggt taattccgat aacgaacgag actctaccct attaaatagt 660

gacagtattg tattttttgt gctgatcact tcttagaggg actggcaaat tgaaagctgc 720

acgaaaaaga gcaataacag gtctgtgatg cccttcgatg tccggggctg cacgcgcgct 780

aaaatgaaag cgtcaacg 798

去获取专利，查看全文>