一株能降低黄酒中生物胺的酿酒酵母及其构建方法与应用

摘要

一株能降低黄酒中生物胺的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用，属于分子生物学技术领域。本发明提供的酿酒酵母菌，是敲除了酿酒酵母的PEP4前肽基因，获得低蛋白酶A活力的酿酒酵母工程菌并将其应用于发酵生产低生物胺含量的黄酒。该菌在其它发酵性能不受影响的情况下，转化子菌株与亲本菌株相比：模拟半固态发酵后，主要的生物胺含量都有所降低，其中酪胺、尸胺和组胺含量下降最多，较原菌分别降低了57.5%，24.6%，和54.3%；筛选得到的工程菌对发酵设备及条件没有特殊要求，一般酒厂的设备和条件均可使用，因而有广泛的应用前景，能为黄酒的安全生产提供重要保障。

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一株能降低黄酒发酵中生物胺含量的酿酒酵母基因工程菌及其应用。 

背景技术：

生物胺是一类碱性含氮化合物，主要由微生物体内的游离氨基酸脱羧而成。因为其潜在的毒性作用和对生产卫生条件的指示作用而受到消费者、制造商和研究者的广泛关注，是目前食品安全问题研究的主要对象之一。其中，酪胺，尸胺，腐胺在各种发酵食品中存在最为广泛，含量也相对较高，危害较大。 

一般来说，由微生物生产生物胺有三个条件：一、有可利用的自由氨基酸；二、氨基酸脱羧酶阳性微生物的存在；三、有适宜的环境条件，利于细菌的生长、脱羧酶的合成和提高脱羧酶活性的条件。 

酵母蛋白酶A(PrA)是蛋白酶中最主要的水解酶之一，它能催化细胞内蛋白质水解，特别在氮缺乏、孢子形成时，酵母通过PrA水解蛋白质为孢子合成新蛋白提供氨基酸来源。PrA是一种天冬氨酸蛋白酶，由XVI号染色体上的PEP4基因编码。改变PrA的前驱物pro-PrA的氨基酸组成能降低PrA的酶活。在很多发酵食品生产过程中，除了来源于原料中的氨基酸，PrA水解蛋白质也是自由氨基酸产生的原因之一。 

近年来，国内已有一些资深企业、高校和科研机构利用该手段对酿酒酵母的PrA编码基因PEP4进行了相关的研究和探讨，并在降低纯生啤酒PrA活力、提高泡持性方面取得了实质性的进展。本发明同样利用基因工程手段构建低表达PrA的酿酒酵母工业菌株，但其目的与用途和上述研究成果截然不同。 

有文献报道，改变PrA的前驱物—proPrA的氨基酸组成能降低PrA的酶活，其理论依据是proPrA含有从高尔基体定位至液泡的分选信号，该分选信号就包含在N-端由54个氨基酸组成的前肽中(图1)。当proPrA进入液泡之前，N-端的前肽将会在完成定位作用后被水解下来，从而使成熟的PrA进入液泡。该54氨基酸组成的前肽除涉及PrA的抑制/活化的转换作用外，对于形成成熟的活性PrA具有极其关键的作用。而且在PrA形成过程的前期，如果缺乏该54氨基酸的肽段，PrA进入内质网中时将会被完全降解。因此，本发明基于这一理论，采用同源重组技术敲除该54个氨基酸组成的前肽编码序列，即PEP4前肽基因，从而构建一株PrA低表达的基因工程菌。 

目前报导最多的具有氨基酸脱羧酶活性的微生物主要是乳酸菌，肠杆菌，假单胞菌等细菌。许多属的乳酸菌具有氨基酸脱羧能力，这一反应有利于乳酸菌的在酸性环境中的生长和存活，因为产生的生物胺可以使环境的pH上升。 

黄酒是我国的民族特产，也称为米酒(rice wine)，属于酿造酒，是世界三大最古老的酒种(黄酒、葡萄酒和啤酒)之一。黄酒是以稻米、黍米、小米、玉米、小麦等为主要酿造原料，由多种微生物(霉菌、酵母和细菌)共同参与，在开放式的环境中酿制而成的一种低酒精度发酵酒，一般酒精含量为14％～20％。 

黄酒具有丰富的营养价值，黄酒中氨基酸含量远远高于其他酒类，是啤酒的9.8倍和葡萄酒3.5倍，其种类超过21种，特别包含了人体必需的8种氨基酸。黄酒中氨基酸的来源主要是米饭和麦曲中所含蛋白质经蛋白酶分解后产生的氨基酸和酵母等微生物自溶后内容物释放产生，有“液体蛋糕”之称。 

由于黄酒生产的开放式多菌种发酵，及大量丰富的氨基酸的存在，目前黄酒中普遍检测到存在生物胺等潜在的有害物质，因此降低黄酒中生物胺含量是黄酒工业急需解决的难题之一。 

发明内容：

本发明所要解决的技术问题就是针对目前黄酒中普遍存在生物胺的缺陷，提供一株敲除PEP4前肽基因的酿酒酵母基因工程菌以及该菌株在降低黄酒中生物胺含量方面的应用，其能减少在黄酒发酵后期由于酵母自溶PrA分泌到胞外分解菌体等蛋白质产生自由氨基酸的量，从而降低生物胺的生成。 

本发明的技术方案之一是：提供一株酿酒酵母基因工程菌，所述基因工程菌为用于黄酒生产的酿酒酵母中敲除酵母蛋白酶A编码基因的前肽基因，即PEP4前肽基因所得； 

所述PEP4前肽基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1； 

优选的，所述基因工程菌的出发菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)RY1，编号CGMCC No2.1525。 

本发明所采用的技术方案之二是：一种用于基因敲除的重组质粒，其依次含有酵母蛋白酶A编码基因PEP4前肽基因的上、下游两条同源臂以及标记基因KanMX； 

所述PEP4前肽基因的同源重组上游同源臂片段长311bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2； 

所述PEP4前肽基因的同源重组下游同源臂片段长319bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3； 

所述标记基因KanMX为带有G418抗性的标记基因； 

所述重组质粒的载体为pUC19质粒。 

本发明所采用的技术方案之三是：一种构建敲除PEP4前肽基因的酿酒酵母基因工程菌的方法，包括以下步骤： 

(1)将含有PEP4前肽基因同源臂的DNA分子及标记基因KanMX插入质粒中，得到重组质粒； 

所述含有PEP4前肽基因同源臂的DNA分子为PEP4前肽基因上游同源臂基因片段和下游同源臂基因片段； 

(2)以重组质粒为模板扩增出含有PEP4前肽基因同源臂及标记基因KanMX的重组片段，将重组片段转化入出发菌株的两种单倍体菌株(a型和α型)中，得到重组后的基因工程单倍体菌株a1和α1； 

(3)将pGAPza质粒导入所述重组后的基因工程单倍体菌株a1和α1中，纯化并融合后得到所述基因工程菌。 

具体如下： 

(1)重组质粒的构建 

将含有PEP4前肽基因同源臂的DNA分子及标记基因KanMX插入质粒中，得到重组质粒； 

所述含有PEP4前肽基因同源臂的DNA分子为PEP4前肽基因上游同源臂基因片段和下游同源臂基因片段； 

(2)PEP4前肽基因的敲除 

①以步骤(1)中的重组质粒为模板，扩增出含有PEP4前肽基因同源臂及标记基因KanMX的重组片段； 

②用醋酸锂转化法将①中的重组片段转化入出发菌株的a型和α型菌株中，得到重组后的基因工程单倍体菌株； 

(3)KanMX抗性基因的去除 

①利用醋酸锂转化法将pGAPza质粒转入步骤(2)-②中的基因工程单倍体菌株中， 

②用Zeocin抗性平板筛选转化子，挑选在YEPD平板上生长而在G418平板上不生长的基因工程单倍体菌株，包括a型和α型。 

(4)pGAPza质粒丢失 

将步骤(3)-②中挑选的a型和α型基因工程单倍体菌株于YEPD液体培养基中进行传代培养，选取第一代及第八代以后各培养物提取酵母质粒并以此为模板，用引物Zeocin-up与Zeocin-down进行PCR扩增，验证pGAPza质粒是否丢失。 

(5)获得基因工程菌 

将步骤(4)中验证得到的pGAPza质粒丢失的a型和α型单倍体酵母突变株经纯化后进行融合，筛选双倍体即得到所述基因工程菌。 

本发明所采用的技术方案之四是：提供一种所述基因工程菌应用于黄酒发酵中的生产方法。 

取所述基因工程菌一环，接种于5mL麦芽汁培养基中，30℃，150r/min，摇瓶发酵12h后全部转接于相同麦芽汁的50mL三角瓶中，30℃，150r/min，继续摇瓶发酵24h后按10％ 的接种量接种到大米固体培养基中，30℃恒温培养箱中进行前酵实验，5天后，调整恒温培养箱温度至30℃进行后酵实验15天。 

所述麦芽汁培养基的制备： 

大麦芽1000g，粉碎成粉，将粉好的麦芽粉加入4倍体积水(水温60℃)至于小锅中糖化，小锅至于55℃-60℃的恒温水浴中糖化5-6h，期间不断搅拌。糖化液纱布静置过滤，过滤后的糖化液煮沸1h,冷却，双层纱布过滤一次，即得到澄清麦芽汁，麦芽汁糖度在12-13Bix。115℃，15min灭菌。 

所述大米固体培养基的制备： 

浸米：25-30℃，浸渍72h； 

洗米：洗米时保留部分的浸米水，刚洗米的三道水倒掉，保留米浆水的乳酸味同时不要味道太重； 

蒸煮：浸好的大米常压蒸50min左右，直到颗粒均匀、内心无白，冷却； 

配料：粳米：100g；熟麦曲：10g；水：105ml(清水60ml、浆水45ml，不包括浸米吸水和蒸饭吸水)接种量：10％(30mL)。 

有益效果： 

1、本发明敲除了黄酒酵母中PEP4前肽基因，得到PrA活力显著降低的酿酒酵母基因工程菌，并首次以降低黄酒发酵过程中的生物胺含量为目的将该类基因工程菌用于黄酒发酵生产中，获得低生物胺含量的产品。 

2、本发明获得的黄酒酵母基因工程菌与初始出发菌株酿酒酵母相比：模拟半固态发酵后，主要的生物胺含量都有所降低，其中酪胺、尸胺和组胺含量下降最多，较原菌分别降低了57.5％,24.6％,和54.3％；筛选得到的工程菌对发酵设备及条件没有特殊要求，一般酒厂的设备和条件均可使用，因而有广泛的应用前景，能为黄酒的安全生产提供重要保障。 

附图说明：

图1是PEP4基因编码蛋白酶A的示范性结构 

图2是重组质粒的构建示意图 

图3是重组质粒质粒的酶切验证图 

图4是同源重组过程 

图5是重组黄酒酵母单倍体的验证 

其中(a)为a型重组单倍体验证；(b)为α型重组单倍体验证 

图6是KanMX抗性基因剔除PCR验证 

其中(A)为a型重组单倍体验证；(B)为α型重组单倍体验证 

图7是单倍体pGAPza质粒丢失PCR验证 

其中1，2泳道为a型重组单倍体验证；3，4泳道为α型重组单倍体验证。 

具体实施方式：

本发明所使用的出发菌株是可以采用任何来源的酿酒酵母双倍体菌株。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。 

实施例1： 

根据Genebank中的酵母基因组数据和整合质粒序列，设计了下述实施例中各引物。 

表1.本实施例中所用到的引物 

本发明所述基因工程菌的构造过程如下： 

1)，将纯化的PEP4前肽基因同源重组的上游同源臂A片段用Hind III进行单酶切，与经同样酶切后的pUC19质粒连接，构建重组质粒1； 

2)，将纯化的PEP4前肽基因同源重组的下游同源臂B片段用Sac I进行单酶切，与经同样酶切后的重组质粒1连接，构建重组质粒2； 

3)，将KanMX基因片段用Kpn I进行单酶切，与经同样酶切后的重组质粒2连接，构建重组质粒3； 

图3为重组质粒3的验证电泳图，采用kpn I单酶切验证，分别得到，1470bp和3476bp两条片段，其中Marker为5000bp。 

4)，以重组质粒3为模板，用引物A-up和B-down扩增2310bp大小的重组片段A-KanMX-B。经试剂盒回收后，用醋酸锂转化法将重组片段A-KanMX-B转化入a型和α型出发菌株酿酒酵母RY1中，在KanMX抗性平板上筛选得到重组后的a型和α型基因工程单 倍体菌株a1和α1，示意图如图4所示。提取转化子a1和α1的基因组DNA，并以此为模板，进行PCR验证。以实验设计的上下游引物YZ1-up和YZ1-down、YZ2-up和YZ2-down进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测目的基因片段，转化子a1和α1的基因组分别扩增出了2022bp和1651bp大小条带，从电泳结果(图5)可以看出，PCR产物大小与预期一致。此结果说明片段A-KanMX-B已经成功整合到出发菌株的染色体基因组上。 

5)，利用醋酸锂转化法将pGAPza质粒转入上述a型和α型基因工程单倍体菌株a1和α1中，用Zeocin抗性平板筛选转化子，挑选在YEPD平板上生长而在G418平板上不生长的a型和α型基因工程单倍体菌株，命名为a2和α2。提取其基因组DNA，并以此基因组DNA为模板，用引物Kan-up和Kan-down进行PCR扩增，应分别扩增出1610bp与100bp左右大小片段。经琼脂糖凝胶电泳(图6)与预期大小一致，进一步证明重组a型和α型基因工程单倍体菌株a2和α2基因组上KanMX基因已被成功剔除。 

6)，将突变株a2和α2于YEPD液体培养基中进行传代培养，选取a2和α2第一代及第八代以后各培养物提取酵母质粒并以此为模板，用引物Zeocin-up与Zeocin-down进行PCR扩增，验证pGAPza质粒是否丢失(图7)。 

7)，将纯化后的酿酒酵母a2和α2单倍体进行融合，筛选双倍体，即得所述基因工程菌。 

实施例2： 

将实施例1中所得的基因工程菌和出发菌株酿酒酵母RY1各取一环，接种于5mL麦芽汁培养基中，30℃，150r/min，摇瓶发酵12h后全部转接于相同麦芽汁的50mL三角瓶中，30℃，150r/min，继续摇瓶发酵24h后按10％的接种量接种到大米固体培养基中，30℃恒温培养箱中进行前酵实验，5天后，调整恒温培养箱温度至30℃后酵实验15天。发酵结束后，取上清液过膜，液相色谱备用待测，同时对发酵液进行分析，包括失重，残糖，酒精度，和重要香气物质的含量。结果如下表2，表3。由结果可知，黄酒中主要的生物胺含量都有所降低，其中酪胺、尸胺和组胺含量下降最多，较原菌分别降低了57.5％,24.6％,和54.3％，其相对应的氨基酸含量也有所下降。 

麦芽汁培养基的制备： 

大麦芽1000g，粉碎成粉，粉好的麦芽粉加入4倍体积水(水温60℃)至于小锅中糖化，小锅至于55℃-60℃的恒温水浴中糖化5-6h，期间不断搅拌。糖化液纱布静置过滤，过滤后的糖化液煮沸1h,冷却，双层纱布过滤一次，即得到澄清麦芽汁，麦芽汁糖度在12-13Bix。115℃，15min灭菌。 

大米固体培养基的制备： 

浸米：25-30℃，浸渍72h； 

洗米：洗米时保留部分的浸米水，刚洗米的三道水倒掉，保留米浆水的乳酸味同时不要 味道太重； 

蒸煮：浸好的大米常压蒸50min左右，直到颗粒均匀、内心无白，冷却； 

配料：粳米：100g；熟麦曲：10g；水：105ml(清水60ml、浆水45ml，不包括浸米吸水和蒸饭吸水)接种量：10％(30mL)。 

液相检测条件： 

色谱柱C18(4.6×150mm ID,5μm)，流动相：乙腈：水(v:v＝65:35)，流速为0.8ml/min，紫外检测波长为254nm，进样量20μl。 

样品的衍生方法： 

1ml的生物胺标准混合溶液，加入200μl的2M NaOH使之呈碱性，然后加入300μl的饱和NaHCO₃溶液进行缓冲，再加入1ml的丹磺酰氯溶液(10mg/ml丙酮)，在65℃的水浴中，30min后取出，加入100μl的氨水中断反应，并去除多余的丹磺酰氯。最后用乙腈调整到5ml。将其用0.45μm的有机滤膜过滤后待测。 

表2.黄酒发酵液中生物胺和氨基酸的含量 

氨基酸/含量/菌种 RY1 RY1-PEP4 5-羟基色氨酸(mg/mL) 0.99±0.05 0.69±0.02 酪氨酸(mg/mL) 0.62±0.02 0.29±0.02 鸟氨酸(mg/mL) 0.68±0.05 0.43±0.03 赖氨酸(mg/mL) 0.61±0.04 0.38±0.04 组氨酸(mg/mL) 0.33±0.01 0.19±0.02 血清素(mg/L) 78.1±0.8 68.2±0.6 酪胺(mg/L) 41.4±0.5 17.6±0.4 腐胺(mg/L) 29.3±0.4 27.2±0.3 尸胺(mg/L) 23.2±0.3 17.5±0.3 组胺(mg/L) 8.1±0.1 3.7±0.1 pH 4.14±0.31 5.05±0.22

表3.不同菌株发酵性能对比