降低黄酒中生物胺含量的黄酒酵母选育

摘要

生物胺是一类小分子含氮化合物，主要由微生物体内的游离氨基酸经氨基酸脱羧酶作用发生脱羧反应而生成，是食品质量及安全的重要衡量指标。黄酒归类于酿造酒，是我国的民族特产之一，也是世界三大最古老的酒种（黄酒、葡萄酒和啤酒）之一。黄酒的酿造是一个混菌（霉菌、酵母和细菌多菌种参与）开放式发酵过程。这样的酿造方式保持了黄酒独特的风味与醇厚的特点，但多菌种发酵过程复杂，难以控制，很容易产生生物胺等一些潜在的危害物质。
　　本文以黄酒酵母为研究对象，通过选育低蛋白酶A(PrA)活性的黄酒酵母，研究了蛋白酶A对黄酒酿造中生物胺产生的影响。主要研究内容如下:
　　(1)通过紫外诱变，以蛋白水解圈平板为初筛条件，筛选低蛋白酶A活力的黄酒酵母菌株。通过复筛结果表明，紫外诱变获得的菌株其蛋白酶A活力并没有明显降低，因此需要利用其它诱变方法和筛选条件进行低蛋白酶A活力菌株的选育。
　　(2)通过重组质粒pUC-ABK（以编码蛋白酶A的PEP4基因前肽编码区的两侧DNA片段A和B为同源序列，以KanMX基因为遗传标记构建而成）获得了PEP4基因前肽编码序列缺失的突变株RY1-a-PEP4，RY1-α-PEP4。将突变株RY1-a-PEP4和RY1-α-PEP4进行了融合，得到双倍体突变株RY1-PEP4。
　　(3)对亲本RY1、RY1-a和RY1-α和选育的菌株RY1-a-PEP4、RY1-α-PEP4、RY1-PEP4分别进行了黄酒发酵实验。结果表明，相对出发菌株，利用RY1-PEP4发酵的黄酒中生物胺含量降低较为明显，其中酪胺、尸胺、腐胺分别下降了60.87％、23.86％和50.75％，其它发酵性能未有明显的变化。选育低蛋白酶A活力的酵母菌株将为降低黄酒中生物胺含量、实现黄酒安全生产提供一种新的策略。生物胺

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 黄酒概述

1．1．1 黄酒历史及发展现状

1．1．2 黄酒中的主要风味物质

1．1．3 黄酒中的有害物质

1．2 生物胺概述

1．2．1 生物胺简介

1．2．2 生物胺的生理功能及危害

1．2．3 生物胺的检测方法

1．2．4 发酵食品中生物胺的产生

1．3 蛋白酶A研究概述

1．3．1 蛋白酶A的来源及作用

1．3．2 蛋白酶A的特性

1．3．3 选育低蛋白酶A活性酵母菌株

1．4 本课题的立题依据及研究内容

1．4．1 立题依据

1．4．2 研究内容

2 材料与方法

2．1 材料与仪器

2．1．1 主要实验仪器

2．1．2 主要实验试剂

2．1．3 菌种和质粒

2．1．4 主要培养基

2．1．5 主要实验溶液

2．2 分析方法

2．2．1 蛋白酶A活力的测定——荧光底物法

2．2．2 生长曲线

2．2．3 酒精度的测定

2．2．4 CO2失重的测定

2．2．5 还原糖的测定

2．2．6 挥发性风味物质含量的测定

2．3 实验方法

2．3．1 紫外诱变育种

2．3．2 分子育种

2．3．3 麦芽汁制备方法

2．3．4 黄酒发酵法

2．3．5 氨基酸检测方法

2．3．6 生物胺检测方法

2．3．7 酪胺检测方法

3 结果与讨论

3．1 酪胺检测方法的建立

3．1．1 单一酪胺的液相色谱检测

3．1．2 标准曲线

3．1．3 检测方法的重复性和重现性实验

3．1．4 检测方法的回收性实验

3．2 氮源对黄酒发酵产生物胺的影响

3．2．1 氮源在黄酒发酵过程中对氨基酸含量影响分析

3．2．2 氮源在黄酒发酵过程中对生物胺的含量影响分析

3．2．3 小结与讨论

3．3 紫外诱变筛选低蛋白酶A活力的黄酒酵母

3．3．1 出发菌株生长曲线的绘制

3．3．2 紫外(UV)致死曲线的绘制

3．3．3 突变株初筛

3．3．4 突变株复筛

3．3．5 小结与讨论

3．4 分子方法筛选低蛋白酶A活力的黄酒酵母

3．4．1 出发质粒

3．4．2 A-KanMX-B片段转化实验室酵母菌株RY1-a，RY1-α

3．4．3 转化子的筛选和获得

3．4．4 转化子与出发菌株蛋白酶A活力比较

3．4．5 二倍体重组菌株RY1-PEP4的获得

3．4．6 小结与讨论

3．5 重组菌株与出发菌株黄酒发酵实验

3．5．1 重组菌株与出发菌株生长性能比较

3．5．2 生物胺及相应氨基酸含量分析

3．5．3 基本发酵性能比较

3．5．4 小结与讨论

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间论文发表情况

致谢