同步糖化发酵生产乳链菌肽和乳酸的方法及在饲料中应用

摘要

本发明公开一种同步糖化发酵生产乳链菌肽和乳酸的方法及在饲料中应用，以木质纤维素为原料，纤维素酶将木质纤维素水解成单糖，产乳链菌肽和乳酸的乳酸乳球菌Lactococcuslactissubsp.lactis，将单糖同步转化生产乳酸和乳链菌肽。利用木质纤维素，如秸秆、稻草或者木片等同时转化为高附加值的乳链菌肽和乳酸；并将生产的乳酸和乳链菌肽用于牛羊饲料添加剂中，能够青饲料中抑制细菌的繁殖，20日内不腐败；用于饲养牛羊后日增重比对照组提高10%，节省饲料10%，提高养殖利润，同时，牛羊的粪便排泄量减少，最高可减少5%，刺激气味减弱，从侧面反映了，饲料的利用率提高，并且具有很好的环保效应。

说明书

 

技术领域

本发明公开一种同步糖化发酵生产乳链菌肽和乳酸的方法及在饲料中应用，属于生物工程领域。

技术背景

对木质纤维素进行生物利用一般采用同步糖化发酵。同步糖化发酵是糖化和发酵同时进行的发酵方式，纤维素酶所释放的葡萄糖由微生物发酵得到最终产品，从而消除了还原糖对纤维素酶的产物抑制作用，减少纤维素酶的用量，降低了成本。因此，比起木质纤维素原料单独水解和发酵，同步糖化发酵具有许多优势，从而被广泛用于生产乙醇或者乳酸等化工产品。

乳链菌肽（Nisin）是A型羊毛硫细菌素，分子式为C₁₄₃H₂₅₈N₄₂O₃₇S₇，它是一种天然生物活性抗菌肽，对革兰氏阳性菌有较强的抑制作用。乳链菌肽对热稳定，能被消化道吸收消化转化氨基酸。1969年联合国粮食及农业组织/世界卫生组织（FAO/WHO）确认Nisin为安全、高效、可靠的食品防腐剂，并于1988年被美国食品及药品管理局（FDA）认证。1990年中国卫生部批准使用乳链菌肽。乳链菌肽作为一种无毒的食品防腐剂，在乳制品、肉制品、饮料、农业饲料、蔬菜水果、酿造酒、袋装食品、调味品以及医药方面中都有很广泛的应用。

尽管目前有利用纤维素同步糖化发酵生产乳酸方面的工作(CN101805759、CN101418272、CN102776248、CN102851331)，但这些工作都是生产乳酸这种单一产品。利用木质纤维素作为原料同时生产乳酸和乳链菌肽还未见报道。

乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp.lactis可以同时生产乳链菌肽和乳酸。在本发明中，我们利用乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp.lactis，采用木质纤维素同步糖化发酵生产乳链菌肽和乳酸两种产品。在对木质纤维素资源，如秸秆、稻草或者木片等，进行利用的同时，同时生产两种化工产品。而乳链菌肽和乳酸在工农业生产中有很大的应用前景。

随着饲料行业的蓬勃发展，饲料逐步向低药、低残留发展，因此，生物饲料的发展也是大势所趋。牛羊等复胃动物的新型健康饲料的开发更为急迫。目前牛羊养殖业面临的主要问题是饲料成本高，青贮饲料容易腐败，无法长期保存。另外，在牛羊的瘤胃中，产烷微生物能够利用氢、CO和甲酸盐作为底物发酵产生甲烷，该过程要消耗反刍动物约7 %的摄入能量。将乳链菌肽和乳酸混合物加入青贮饲料，可以抑制有害细菌的繁殖，从而保证饲料卫生低毒。将含乳链菌肽和乳酸的饲料饲喂牛羊，可以抑制产烷微生物生长，从而减少牛羊摄入的能量消耗，增加肉料比。

发明内容

本发明公开了一种同步糖化发酵生产乳链菌肽和乳酸的方法，以木质纤维素为原料，用纤维素酶和乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp.lactis同步糖化发酵，同时生产乳酸和乳链菌肽。

本发明进一步提供了上述方法制备的乳链菌肽和乳酸在饲料中用途。

本发明提供同步糖化发酵生产乳链菌肽和乳酸的方法，技术解决方案如下：

以木质纤维素为原料，纤维素酶将木质纤维素水解成单糖，产乳链菌肽和乳酸的乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp.lactis，将单糖同步转化生产乳酸和乳链菌肽。  

本发明提供的一种同步糖化发酵生产乳链菌肽和乳酸的方法，包括以下具体步骤：

1、用液体培养基培养乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp.lactis。

将乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp.lactis接种到液体培养基中，37℃培养。

液体培养基成分为：葡萄糖 10 g/L，酵母浸粉10 g/L， KH₂PO₄ 10 g/L，NaCl 2 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L。121℃灭菌30 min。

2、用木质纤维素总体积12～14倍的水对预处理后的木质纤维素进行清洗，要求最终水洗液中葡萄糖浓度小于0.1g/L，以降低葡萄糖对酶解反应的负反馈抑制，同时洗去有毒物质如糠醛等。所述的木质纤维素选自麦秸、玉米秸秆、高粱秸、芦苇、稻草、木屑或竹粉。

3、将水洗处理后的木质纤维素加入2.5%~10%（v/w）柠檬酸缓冲液中，再加入1~5g/L g/L NaCl、1~0.5g/L MgSO₄·7H₂O、1~20g/L KH₂PO₄、1%~4%酵母粉、2%~8%蛋白胨，10g/L~50 g/L CaCO₃，补足去离子水到40g，实际纤维素添加量为总体系的1%～6%。将固液混合物pH值调到4.5~7.0后，加入反应器（锥形瓶或发酵罐），高温高压灭菌。

4、向步骤3中培养基中加入0.01%～0.06% Tween-80，反应1.5小时后，再添加除菌纤维素酶5 FPU/g ~25 FPU/g纤维素、β-葡糖苷酶0.1 IU /g~10 IU /g纤维素，木聚糖酶0.1 IU /g~10 IU /g纤维素，果胶酶0.1 IU /g~10 IU /g纤维素。50℃ 160rpm预水解3～10小时。

5、预水解后向培养体系中添加培养12小时的乳酸乳球菌Lactococcus lactis subsp.lactis，添加量为总体系的3%～10%。37℃～50℃ 160rpm培养10～100小时。

6、将步骤5发酵液用盐酸调pH2。离心，得到含乳酸和乳链菌肽的上清液。

将本发明制备的乳链菌肽和乳酸均匀撒到青贮饲料上，制成具有保鲜功能的饲料。室温保存3～60天，用它饲喂牛羊。

各原料符合农业部公告第1126号《饲料添加剂品种目录(2008) 》、GBT 19424-2003 天然植物饲料添加剂通则以及GB2760-2011食品添加剂使用标准。

本发明中采用可再生资源木质纤维素作为原料，通过产乳链菌肽的乳酸菌进行同步糖化发酵，同时生产两种具有重要工业价值的产品（乳酸和乳链菌肽）。除此之外，还把同步糖化发酵产物——乳链菌肽和乳酸，用到饲料保鲜和反刍动物饲喂领域。

通过本发明，将可再生资源木质纤维素同时高效转化为两种生物化工产品——乳酸和乳链菌肽，具有重要的应用价值。另外，将本发明所得同步糖化发酵产物——乳链菌肽和乳酸加入牛羊青贮饲料中，可以大大增长饲料保鲜期，提高饲料品质。用发酵后饲料饲喂牛羊，可以提高牛羊的增重率，减少患病率。

本发明的积极效果在于：利用木质纤维素，如秸秆、稻草或者木片等同时转化为高附加值的乳链菌肽和乳酸；并将生产的乳酸和乳链菌肽用于牛羊饲料添加剂中，能够青饲料中抑制细菌的繁殖，20日内不腐败；用于饲养牛羊后日增重比对照组提高10%，节省饲料10%，提高养殖利润，同时，牛羊的粪便排泄量减少，最高可减少5%，刺激气味减弱，从侧面反映了，饲料的利用率提高，并且具有一定的环保效应。

具体实施方式

为了便于理解本发明，特例举以下实施例。其作用被理解为是对本发明的阐释而非对本发明的任何形式的限制。

实施例1

取100ml锥形瓶，分别称取4%的秸秆加入到锥形瓶中，然后向锥形瓶中加入NaCl 2 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，CaCO₃ 30g/L，再向摇瓶中加入2ml pH5柠檬酸缓冲液混匀，补足去离子水至27g，调pH至5，封口称重灭菌。灭菌后放置干燥，称重，计算损失水分进行补水，同时添加0.05%Tween-80反应1.5小时，再加入除菌的纤维素酶15FPU/g、β-葡糖苷酶5 IU/g纤维素、木聚糖酶5 IU/g纤维素、果胶酶5 IU/g纤维素并摇匀，封口后50℃预水解3h。预水解后向反应体系中加10%接种量的含有乳酸菌Lactococcus lactis subsp.lactis的菌液（OD值为2），重新置水浴摇床中37℃，160rpm发酵，发酵96小时。发酵结束后，调pH2。8000rpm离心10min取上清，用高效液相测葡萄糖、木糖和纤维二糖的含量，用乳酸试剂盒测乳酸的产量为28g/L，用琼脂扩散法测乳链菌肽的效价7032IU/ml。

实施例2

取100ml锥形瓶分别称取3%的秸秆加入到锥形瓶中，然后向锥形瓶中加入NaCl 2 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，CaCO₃ 50g/L，再向摇瓶中加入2ml pH5柠檬酸缓冲液混匀，补足去离子水至27g，调pH至5，封口称重灭菌。灭菌后放置干燥，称重，计算损失水分进行补水，同时添加0.05%Tween-80反应1.5小时，再加入除菌的纤维素酶15FPU/g、β-葡糖苷酶5 IU/g纤维素、木聚糖酶5 IU/g纤维素、果胶酶5 IU/g纤维素并摇匀，封口后50℃预水解3h。预水解后向反应体系中加10%接种量的含有乳酸菌Lactococcus lactis subsp.lactis的菌液（OD值为2），重新置水浴摇床中37℃，160rpm发酵，发酵96小时。发酵结束后，调pH2。8000rpm离心10min取上清，用高效液相测葡萄糖、木糖和纤维二糖的含量，用乳酸试剂盒测乳酸的产量24.8g/L，用琼脂扩散法测乳链菌肽的效价6835IU/ml。

实施例3

取100ml锥形瓶，分别称取4%的秸秆加入到锥形瓶中，然后向锥形瓶中加入NaCl 2 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，CaCO₃ 30g/L，再向摇瓶中加入2ml pH5柠檬酸缓冲液混匀，补足去离子水至27g，调pH至5，封口称重灭菌。灭菌后放置干燥，称重，计算损失水分进行补水，同时添加0.05%Tween-80反应1.5小时，再加入除菌的纤维素酶25FPU/g、β-葡糖苷酶10 IU/g纤维素、木聚糖酶5 IU/g纤维素、果胶酶5 IU/g纤维素并摇匀，封口后50℃预水解3h。预水解后向反应体系中加10%接种量的含有乳酸菌Lactococcus lactis subsp.lactis的菌液（OD值为2），重新置水浴摇床中37℃，160rpm发酵，发酵96小时。发酵结束后，调pH2。8000rpm离心10min取上清，用高效液相测葡萄糖、木糖和纤维二糖的含量，用乳酸试剂盒测乳酸的产量20.9g/L，用琼脂扩散法测乳链菌肽的效价7692IU/ml。

实施例4

取100ml锥形瓶，分别称取3%的秸秆加入到锥形瓶中，然后向锥形瓶中加入NaCl 2 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，酵母浸粉20 g/L，蛋白胨40 g/L，CaCO₃ 50g/L，再向摇瓶中加入2ml pH5柠檬酸缓冲液混匀，补足去离子水至27g，调pH至5，封口称重灭菌。灭菌后放置干燥，称重，计算损失水分进行补水，同时添加0.05%Tween-80反应1.5小时，再加入除菌的纤维素酶15FPU/g、β-葡糖苷酶10 IU/g纤维素、木聚糖酶8 IU/g纤维素、果胶酶5 IU/g纤维素并摇匀，封口后50℃预水解3h。预水解后向反应体系中加10%接种量的含有乳酸菌Lactococcus lactis subsp.lactis的菌液（OD值为2），重新置水浴摇床中37℃，160rpm发酵，发酵96小时。发酵结束后，调pH2。8000rpm离心10min取上清，用高效液相测葡萄糖、木糖和纤维二糖的含量，用乳酸试剂盒测乳酸的产量26.7g/L，用琼脂扩散法测乳链菌肽的效价6368IU/ml。

实施例5

取100ml锥形瓶，分别称取3%的秸秆加入到锥形瓶中，然后向锥形瓶中加入NaCl 2 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，CaCO₃ 30g/L，再向摇瓶中加入2ml pH5柠檬酸缓冲液混匀，补足去离子水至27g，调pH至6.5，封口称重灭菌。灭菌后放置干燥，称重，计算损失水分进行补水，同时添加0.05%Tween-80反应1.5小时，再加入除菌的纤维素酶15FPU/g、β-葡糖苷酶5 IU/g纤维素、木聚糖酶5 IU/g纤维素、果胶酶10 IU/g纤维素并摇匀，封口后50℃预水解3h。预水解后向反应体系中加10%接种量的含有乳酸菌Lactococcus lactis subsp.lactis的菌液（OD值为2），重新置水浴摇床中50℃，160rpm发酵，发酵96小时。发酵结束后，调pH2。8000rpm离心10min取上清，用高效液相测葡萄糖、木糖和纤维二糖的含量，用乳酸试剂盒测乳酸的产量22.9g/L，用琼脂扩散法测乳链菌肽的效价6198IU/ml。

实施例6

取100ml锥形瓶，分别称取3%的秸秆加入到锥形瓶中，然后向锥形瓶中加入NaCl 2 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，酵母浸粉20 g/L，蛋白胨40 g/L，CaCO₃ 50g/L，再向摇瓶中加入2ml pH5柠檬酸缓冲液混匀，补足去离子水至27g，调pH至5.5，封口称重灭菌。灭菌后放置干燥，称重，计算损失水分进行补水，同时添加0.03%Tween-80反应1.5小时，再加入除菌的纤维素酶15FPU/g、β-葡糖苷酶5 IU/g纤维素、木聚糖酶10 IU/g纤维素、果胶酶5 IU/g纤维素并摇匀，封口后50℃预水解3h。预水解后向反应体系中加10%接种量的含有乳酸菌Lactococcus lactis subsp.lactis的菌液（OD值为2），重新置水浴摇床中37℃，160rpm发酵，发酵96小时。发酵结束后，调pH2。8000rpm离心10min取上清，用高效液相测葡萄糖、木糖和纤维二糖的含量，用乳酸试剂盒测乳酸的产量27.6g/L，用琼脂扩散法测乳链菌肽的效价6764IU/ml。

实施例7

采用10 L发酵罐，装液量为8 L，接种量10%，种龄12 h，加入4%底物，培养温度37℃，搅拌转速160 rpm， 加入NaCl 2 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，CaCO₃ 50g/L，加去离子水到8L，灭菌后添加0.06%Tween-80反应1.5小时，再加入除菌的纤维素酶15FPU/g、β-葡糖苷酶10 IU/g纤维素、木聚糖酶5 IU/g纤维素、果胶酶5 IU/g纤维素并摇匀，预水解5h，向发酵罐中添加10%的含有乳酸菌Lactococcus lactis subsp.lactis的菌液（OD值为2）。通气量为16 L/min，溶氧量为30%发酵168h。发酵结束后，调pH5。8000rpm离心10min取上清，用高效液相测葡萄糖、木糖和纤维二糖的含量，对样品酸化后，用乳酸试剂盒测乳酸的产量39g/L，用琼脂扩散法测乳链菌肽的效价8230IU/ml。

试验例1

将本发明实施例1~实施例7发酵液离心，取上清，将上清加入青贮饲料后，室温放置20天，取样，与未加发酵液的青贮饲料比较。未加发酵液的青贮饲料腐烂，有异味，而加发酵液的饲料则未见腐败，无异味。试验表明，本发明对青贮饲料具有明显的保鲜作用。

试验例2

以吉林省金波青贮玉米种业有限公司生产的“金岭青贮367” 青贮饲料为实验饲料；将本发明实施例1~实施例7发酵液离心，取上清，按5%比例加入“金岭青贮367”，作为试验组，不添加任何添加剂的“金岭青贮367”为对照组，按常规的饲养方法喂养肉食牛，饲喂100天，牛的体重变化、平均日增重结果如表一，粪便及病情检测结果如表2和3。

表1  牛的体重变化

表2 粪便检测统计

表3 病情检测统计表

组别  体内寄生虫胃肠道疾病  呼吸道疾病  急性病实施例1   无无一例无实施例2   无无无无实施例3无无无一例实施例4无无无无实施例5无无一例无实施例6无无无无实施例7无无无无青贮饲料   无三例无两例