一株产细菌素双歧杆菌及其在抑制酸奶后酸化中的应用

摘要

本发明涉及一株产细菌素双歧杆菌及其在抑制酸奶后酸化中的应用。动物双歧杆菌乳亚种L-SN，来自广西巴马长寿老人肠道，产双歧杆菌细菌素的最佳条件为初始pH6.5，30℃厌氧培养16h。所产细菌素对酸奶发酵剂菌株保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌，食源性病原菌金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌有显著地抑制效果。将L-SN添加于酸奶中，能有效抑制后酸化，使酸奶在20d贮藏期内维持酸度为100～110°T、pH4.1～4.2、活菌数≥106cfu/mL，并能显著提高酸奶的持水力和黏度，赋予酸奶良好的色泽、口感和组织状态。

说明书

1、背景技术：

酸奶是一种含有活性益生菌的乳制品，酸奶在贮存、运输、销售过程中，活性益生菌仍会缓慢生长繁殖，代谢产酸，使酸奶的pH继续下降，出现消费者不可接受的酸味，这种现象称作酸奶后酸化。 

控制酸奶后酸化，便可以适当并延长酸奶的货架期。目前酸奶后酸化的防治方法有：生物育种、调整菌种添加比例，以及添加细菌素nisin。生物育种是指利用诱变育种和基因工程等技术，选育在酸奶发酵时产酸快，而在冷藏时产酸少或者不产酸的菌株，然而这种方法选育周期长，成功率不高，目前并未取得突破性成果。另一方面，调整发酵剂菌种的添加比例可以在一定程度上抑制后酸化，但效果并不理想且难于控制。添加nisin是目前抑制酸奶后酸化的最好办法，然而nisin作为食品防腐添加剂，其应用受到严格的监控与限制，因此，随着大众食品安全意识的提升和国家对食品添加剂控制程度的加强，添加nisin并不是抑制酸奶后酸化的最佳方案。因此亟需寻找更为安全有效的抑制酸奶后酸化的方法。 

双歧杆菌是人体肠道内的优势菌群，具有抗过敏、抗肿瘤、调整肠道功能等多种促进人体健康的作用。某些双歧杆菌在代谢过程中，可通过核糖体机制合成的一类具有抑菌活性的蛋白或多肽类物质，被称为双歧杆菌细菌素。双歧杆菌细菌素，是一种多肽物质，可以被人体内的酶消化，食用安全性较高。双歧杆菌细菌素可以对多种乳酸菌、革兰氏阳性病原菌有良好的抑制作用。目前，对于产细菌素的双歧杆菌及其所产细菌素的报道为数不多。在国内外的研究及专利中，并没有将产细菌素双歧杆菌应用于抑制酸奶后酸化的报道。 

2、发明特点： 

本发明所采用的动物双歧杆菌乳亚种L-SN（Bifidobacterium animalis subsp.lactis L-SN），保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，保藏日期为2013年6月19日，保藏号为CGMCC7763。L-SN可产双歧杆菌细菌素，细菌素最佳生产条件为初始pH6.5,，30℃厌氧培养至16h，以植物乳杆菌Pl2（Lactobacillus plantarum Pl2）为指示菌，所产细菌素抑菌圈直径达到15.7mm/100ul培养液。该细菌素对酸奶发酵剂菌株保加利亚乳杆菌，嗜热链球菌，食源性病原菌金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌有显著地抑制效果。将L-SN添加于酸奶中，能有效抑制后酸化，使酸奶在20d贮藏期内维持酸度为100～110°T、pH4.1～4.2、活菌数≥10⁶CFU/ml，并能显著提高酸奶的持水力和黏度，赋予酸奶良好的色泽、口感和组织状态。 

3、本发明所提供的一株产细菌素双歧杆菌及其在抗酸奶后酸化中的应用，包括以下步骤： 

3.1双歧杆菌L-SN的鉴定 

3.1.1形态学鉴定 

将双歧杆菌L-SN在MRS厌氧管中滚管后，37℃培养20h观察单菌落形态，如图1所示，继续培养至24h后进行革兰氏染色，光学显微镜观察记录菌体形态，如图2所示。 

3.1.2生理生化鉴定 

参照凌代文的《乳酸菌细菌分类鉴定及实验方法》进行糖醇发酵试验及特异性酶F6PPK试验，结果如表1所示,初步鉴定菌株L-SN为动物双歧杆菌（Bifidobacterium animails）。 

表1菌株L-SN生理生化试验结果 

Table.1Microbiological identification of strain L-SN 

注：+表示阳性，-表示阴性。 

3.1.316S rRNA鉴定 

采用细菌基因组DNA快速提取试剂盒（北京博迈德科技发展有限公司），取培养12h的新鲜目标菌株菌液，按照试剂盒说明，进行菌体基因组DNA的提取。PCR采用25μL反应体系，ddH₂O14.25μL，10×Buffer2.5μL，10mmol/LdNTP2.0μL，10μmol/L上引物2.5μL，10μmol/L下引物2.5μL，Taq酶0.25μL，DNA模版1.0μL，其中空白对照不加入DNA模版。PCR扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s；60℃引物复性30s；70℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。所得PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳在标准条件下进行检测后送至北京博迈德科技发展有限公司测序，测序结果见附件1，建立的系统发育树如图3所示，鉴定菌株L-SN为动物双歧杆菌乳亚种，命名为动物双歧杆菌乳亚种L-SN（Bifidobacterium animalis subsp.lactis L-SN）。 

3.2双歧杆菌产细菌素特性 

3.2.1产细菌素双歧杆菌生长曲线 

分别以1%的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养，在不同时间（0-20h）取样，测OD600，活菌数，pH值，抑菌直径。如图4所示，L-SN在培养6小时左右进入对数 生长期，并在14h左右进入稳定期。进入稳定期后，pH值开始逐渐下降，在18h左右pH值逐渐开始趋于稳定。 

3.2.2细菌素产生时间 

分别在培养时间0h，4h，8h，12h，16h，20h，24h，28h，32h，36h的条件下取样，做抑菌试验，比较不同培养时间抑菌圈直径的差异。由图5可见，在8h左右（对数生长期）细菌素开始产生，在进入稳定期后细菌素产量持续增加，在稳定期（16h～24h）细菌素产量基本维持稳定，16h左右抑菌圈直径达到最高值，约15mm左右。在稳定后期，细菌素的产量逐渐略有所下降，但仍基本保持稳定。 

3.2.3细菌素适宜产生温度 

分别在30℃，37℃，42℃三个温度条件下培养至最适产细菌素时间，做抑菌试验，比较不同培养温度OD600值，活菌数，pH值，抑菌直径的差异。如图6所示，培养温度为30℃时，抑菌圈直径最大。 

3.2.4细菌素适宜产生起始pH值 

分别在培养基起始pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的培养条件下，做抑菌试验，比较不同起始pH对OD600值，活菌数，pH值，抑菌直径的影响。如图7所示，起始pH值在4.5-8时，双歧杆菌均能产生细菌素，并在pH6.5时细菌素有最大产量。 

3.2.5细菌素抑菌谱 

选取乳杆菌、链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、芽孢杆菌、李斯特氏菌等12株菌为指示菌。分别以硫铵沉淀粗提液做抑菌试验，测定抑菌圈直径的大小。本细菌素对实验所用的2株植物乳杆菌，2株保加利亚乳杆菌，1株嗜热链球菌，1株乳脂链球菌，1株金黄色葡萄球菌，2株大肠杆菌，1株李斯特氏菌和2株芽孢杆菌均有不同程度的抑制作用。 

表2L-SN所产细菌素的抑菌谱 

Table2Antimicrobial spectrum of bacteriocin produced by L-SN 

3.3双歧杆菌在抑制酸奶后酸化中的应用 

3.3.1酸奶的制备 

制备流程如图15所示。 

试验共设计5组处理，其中仅含有保加利亚乳杆菌S-1和嗜热链球菌ST的混合发酵剂组为空白对照组；在混合发酵剂基础上强化商用动物双歧杆菌Bb12组为阳性对照组；在混合发酵剂基础上强化产细菌素动物双歧杆菌L-SN组为处理组。将处理组按添加双歧杆菌菌数的不同分为3组：低添加量组，双歧杆菌添加量(2～5)×10⁵cfu/mL；中添加量组，双歧杆菌添加量(2～5)×10⁶cfu/mL；高添加量组，双歧杆菌添加量(2～5)×10⁷cfu/mL。将制备的凝固型酸奶，置于4℃贮藏，每3d测定1次pH、可滴定酸度、活菌数、持水力及黏度。 

凝固型酸奶4℃贮藏20d内pH均有所下降，酸度上升，分别如图8、9所示，与未添加双歧杆菌和添加Bb12的酸奶相比，产细菌素双歧杆菌L-SN的添加，能够显著延缓pH的下降和酸度的上升，暨对酸奶的后酸化起到一定的抑制作用，其中尤以(2～5)×10⁶cfu/mL效果最佳，20d时pH仍维持在4.20左右，可滴定酸度均＜120°T。 

另外，产细菌素双歧杆菌L-SN的添加，对酸乳发酵剂菌株保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的活菌数没有影响，如图10所示，但对双歧杆菌数量有显著影响，如图11所示，添加(2～5)×10⁶cfu/mLL-SN的双歧杆菌为宜，最终活菌数仍能维持在10⁶cfu/mL左右。 

未添加双歧杆菌的空白组和Bb12组酸奶在贮藏第1d时持水力就较差，均在80%左右，而接入双歧杆菌L-SN的3组持水力均高于85%，最高达到90%。随着贮藏时间的延长，5组酸奶持水力均呈下降趋势，但接入产细菌素双歧杆菌L-SN的酸奶样品均优于对照组，其中以(2～5)×10⁷cfu/mL接入的样品持水力效果最好(图12)。 

随着贮藏时间的延长，酸奶黏度均呈现下降的趋势（图13）。Bb12组和加入双歧杆菌L-SN的3组在黏度上都明显优于空白组，其中接入(2～5)×10⁶cfu/mL双歧杆菌L-SN的酸奶组略优于其他2组。 

从色泽、气味与滋味、组织状态3个方面对4℃酸奶成品进行了感官评定，评分结果见表3。空白对照具有较差的感官状态，而中添加量组的感官评价综合评分最高，表明添加一定量的双歧杆菌L-SN菌株可以明显提高酸奶的色泽与组织状态，提高表面光滑感，减少乳清析出与颗粒感，并赋予酸奶合适的甜酸比例与较为香醇的气味和滋味。这说明双歧杆菌L-SN菌株不仅可以合成抑制后酸化的双歧杆菌细菌素，并且可与常规发酵剂菌种混合发酵形成特有的风味物质，增加酸奶风味滋味。 

表3双歧杆菌添加对酸奶感官品质的影响 

Table3Result of sensory evaluation yoghurt with and without bifidobacteria 

4、具体实施方式：

实施例1： 

双歧杆菌细菌素的生产 

动物双歧杆菌乳亚种L-SN，以1%的接种量接种于MRS液体培养基中，初始pH调整至6.5,，30℃厌氧培养至16h，所产双歧杆菌细菌素，以植物乳杆菌Pl2（Lactobacillus plantarum Pl2）为指示菌，抑菌圈直径达到15.7mm/100ul培养液。 

双歧杆菌在抑制酸奶后酸化中的应用 

酸奶的制备如附图15所示。 

双歧杆菌添加量为3×10⁶cfu/mL，成品酸奶在4℃保藏20天，pH为4.17，可滴定酸度99°T，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌总菌数6×10⁵cfu/mL，双歧杆菌活菌数1×10⁶cfu/mL。 

实施例2： 

双歧杆菌在抑制酸奶后酸化中的应用 

酸奶的制备如附图15所示。 

双歧杆菌添加量为3×10⁵cfu/mL，成品酸奶在4℃保藏20天，pH为4.11，可滴定酸度112°T，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌总菌数9×10⁵cfu/mL，双歧杆菌活菌数3×10⁵cfu/mL。 

实施例3： 

双歧杆菌在抑制酸奶后酸化中的应用 

酸奶的制备如附图15所示。 

双歧杆菌添加量为3×10⁷cfu/mL，成品酸奶在4℃保藏20天，pH为4.13，可滴定酸度108°T，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌总菌数4×10⁵cfu/mL，双歧杆菌活菌数6×10⁶cfu/mL。 

5附图说明

图1是菌株L-SN菌落形态图；图2是菌株L-SN菌体形态图；图3是双歧杆菌L-SN16SrRNA系统发育树图；图4是菌株L-SN生长曲线图；图5是双歧杆菌L-SN抑菌活性曲线图；图6是培养温度对细菌素产生的影响图；图7是起始pH对细菌素产生的影响图；图8是酸奶贮藏过程中pH的变化图；图9是酸奶贮藏过程中酸度的变化图；图10是酸奶贮藏过程中保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌总菌数的变化图；图11是酸奶贮藏过程中双歧杆菌活菌数的变化图；图12是酸奶贮藏过程中持水力的变化图；图13是酸奶贮藏过程中黏度的变化图。图14是双歧杆菌酸奶制备流程图。图15是双歧杆菌酸奶制备流程图。 

专利所属项目 

项目编号：31271827 

项目起止时间：2013年1月至2016年12月 

项目负责人：李平兰 

社会效益及经济效益： 

1、主要应用对象：益生菌制剂厂，酸奶发酵剂生产厂，酸奶生产厂。 

2、市场及价格定位： 

酸奶发酵剂生产厂，酸奶生产厂。 

价格定位在与目前酸奶发酵添加双歧杆菌价位相同。 

3、应用效益： 

产细菌素双歧杆菌及其在抗酸奶后酸化中的应用具有可观的经济效益。 

酸奶产品在贮存、运输、销售过程中的后酸化，是限制其货架期的主要因素之一，产细菌素的双歧杆菌的应用不仅能够抑制后酸化现象，适当延长货架期，另外可以强化益生菌，增强酸奶的功能性。 

产细菌素双歧杆菌及其在抗酸奶后酸化中的应用具有良好的社会效益。 

产细菌素双歧杆菌的应用可以减少由于后酸化造成的酸奶的浪费，另外，产细菌素双歧杆菌的应用绿 色，无添加，定能受到消费者的欢迎。