一种耐酸性真菌α-淀粉酶TaAMY及其基因和应用

摘要

本发明涉及基因工程及发酵工程领域，具体地，本发明涉一种耐酸性真菌α-淀粉酶TaAMY及其基因和应用。本发明提供了一种新型耐酸性真菌α-淀粉酶TaAMY，其具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述新型耐酸性真菌α-淀粉酶的基因NTaAMY，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明还提供了包含上述基因的重组载体、重组菌株及其应用。本发明的新型耐酸性真菌α-淀粉酶通过高效表达后能够达到较高的发酵水平，可广泛应用于淀粉制糖、酿造、焙烤制品、医药、饲料等领域。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种耐酸性真菌α-淀粉酶TaAMY及其基因和应用。

背景技术

真菌α-淀粉酶是由真菌如黑曲霉、米曲霉、根霉等产生的，可以随机水解淀粉内部α-1，4糖苷键，也能水解麦芽三糖，终产物主要为麦芽糖和部分低聚寡糖及少量葡萄糖。一般真菌α-淀粉酶的热稳定性不如细菌α-淀粉酶，具有反应温度温和、作用pH范围较窄等特点。

从20世纪50年代开始，英国和美国相继将真菌α-淀粉酶作为食品添加剂应用于面包生产行业。由于真菌α-淀粉酶所具有的特性，以及现代食品工业、发酵工业等的快速发展，真菌α-淀粉酶在现代工业酶制剂中占有显著地位，其应用也越来越广泛。

目前，真菌α-淀粉酶的工业应用主要表现在：

（1）淀粉糖工业：据统计，2006年，我国淀粉糖产量已经达到600万吨。品种也越来越多，有饴糖、高麦芽糖、超高麦芽果糖、液体葡萄糖、结晶和无水葡萄糖、果葡糖、麦芽糊精、低聚糖、全糖、糖醇等20多个品种，这其中主要以葡萄糖和麦芽糖为主，而且麦芽糖由于其特有的性质，越来越受到人们的关注。真菌α-淀粉酶已逐渐替代β-淀粉酶而成为以淀粉为原料生产麦芽糖浆的关键酶，可生产高麦芽糖和低葡萄糖含量的糖浆，因此在淀粉糖工业中应用越来越广泛。

（2）焙烤制品加工：真菌α-淀粉酶可水解面粉中的淀粉生成小分子糊精，通过酵母的进一步发酵产生醇类物质和二氧化碳，从而使焙烤制品体积增大。在此过程中产生的还原糖在烘焙过程中可参与美拉德反应，有助于改善焙烤制品的外表色泽。添加真菌α-淀粉酶，不仅可以加快生面团的发酵速率、改善焙烤制品的结构和体积，还可以明显改善焙烤制品的口感、色泽及品质等。因此，真菌α-淀粉酶可替代溴酸钾、焦亚硫酸钠等化学改良剂，消除目前焙烤食品加工中所用化学改良剂存在的安全隐患。

（3）酿造行业：真菌α-淀粉酶用于啤酒酿造，可提高麦芽汁的可发酵性；用于黄酒酿制，可改善黄酒酒质，提高出酒率；用于生料酒精行业，可对糖化醪中淀粉进行低温液化，提高酒精得率及降低生产成本。

此外，真菌α-淀粉酶还可作为促消化剂应用于医药；可提高动物的饲料利用率、降低料肉比应用于饲料酶制剂等其它领域。而且随着工业的不断发展，真菌α-淀粉酶的应用领域还会不断扩大。

目前，国内酶制剂企业真菌α-淀粉酶的生产水平较低，同处于世界领先水平的几家国外酶制剂企业相比（发酵水平可达到2000-3000U/g左右），差距很大，没有生产及市场竞争优势。因此，提高真菌α-淀粉酶的生产水平，并改善其相应性状，如提高耐酸性或耐热性能，还可进一步拓宽真菌α-淀粉酶的应用范围，这些都对我国酶制剂的研发及生产具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型耐酸性真菌α-淀粉酶TaAMY。

本发明的另一目的是提供编码上述新型耐酸性真菌α-淀粉酶的基因NTaAMY。

本发明的另一目的是提供包含上述新型耐酸性真菌α-淀粉酶的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述新型耐酸性真菌α-淀粉酶基因NTaAMY的重组菌株。

本发明的另一目的是提供制备上述新型耐酸性真菌α-淀粉酶TaAMY的方法。

本发明的另一目的是提供上述新型耐酸性真菌α-淀粉酶TaAMY的应用。

本发明提供了一种来自于黑曲霉（Aspergillus niger）的新型耐酸性真菌α-淀粉酶TaAMY，该新型耐酸性真菌α-淀粉酶TaAMY氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MSQFIECKATAIQRLPSWHSFSKQLPEFKNRRESTKSQTQLGVNRSLIPPWWRHLQ

AIHS                                                           60

TADKTLHFERVPHAMDATPNPTETYDWFQAHKAGLPTNGNVGVISILVLNGEFDD

AGALG                                                          120

YHWGRVGDLVELERQKNAVRGYDLHFAYDLGCKGTYSPLQYKIVDPDGVDSRAE

QDNGTD                                                         180

ISGWTSFRPDKNWTADSVERTKWQWDSDDRWMSALPRSGMFEGPRYPTFPGFQA

DFVPQQ                                                         240

RLDNYDYFSTADLDFSHDVPLVEVFSWEEMIDDVQQLKAIENGARYHLMFARGR

DGINHD                                                         300

RGEAVERLSRVKREFVSGVLRALLAKLGKWEALVDLVPEVREDRLRRETIVIGAA

ARGEL                                                          360

RQTLGDSGGHNYRTYWTDCVVVPGVDLKVFVCESQLPPNCGRILATQRPGPEDFL

ADVMS                                                          420

YGEGRYPYGEAEPGFKPEMGTDLKQRASMRQCVYHAQLAYRARIDHGELYHYT

GYGCLYG                                                        480

LLGPLRKGDHVSVKFDGAADIGFLLYGRMYPVITSVDNLMTCDFVGQPTPVGRW

FHSEKW                                                         540

ALEGPVANAAVPSLVDLNGLTQVGQMV                                    567

该新型耐酸性真菌α-淀粉酶酶蛋白由567个氨基酸组成，其理论pI/Mw为5.75/64080.14。

本发明还提供了编码上述真菌α-淀粉酶的基因NTaAMY，该基因的序列如SEQID NO. 2所示：

1 atgtcccaat tcatagagtg caaagccact gccatacaac gcctcccctc ctggcactcc

61 ttcagtaagc aactccccga attcaaaaac cgccgagaat ccaccaaatc acaaactcaa

121 ctcggtgtaa accgcagcct aataccgcct tggtggcgcc acctccaggc aatccactcc

181 accgcggaca agaccctcca cttcgaacgg gtcccccatg ccatggacgc tacccccaac

241 cccacggaaa cctacgattg gtttcaagcc cataaggctg gcttaccaac aaatggaaat

301 gtaggtgtaa tcagcatctt agtgttgaat ggcgaattcg acgatgcagg agctctgggc

361 taccactggg gcagggttgg agatcttgtt gaattagagc gacagaaaaa tgcagtgcga

421 gggtatgatt tacacttcgc gtatgatcta ggatgcaagg ggacatacag cccccttcaa

481 tacaagatcg tggaccctga tggcgtcgac tcacgcgctg aacaggacaa tggcacagac

541 atctccggct ggacgtcctt ccgccccgac aagaactgga ccgcggatag cgtggagagg

601 acgaaatggc agtgggatag cgatgatcga tggatgtctg ccttgccgcg cagcggaatg

661 ttcgagggtc cgagatatcc caccttcccc ggctttcagg ccgactttgt cccccaacaa

721 cggttagata actatgacta cttctcgacg gcggacctgg acttctcaca cgatgtgccg

781 ctggtagagg tattctcgtg ggaggagatg attgacgacg tgcaacaatt gaaagcaatc

841 gagaacggcg cgaggtatca tctgatgttc gcacgcggca gggatggtat taatcatgat

901 aggggggagg ccgtggagag gttgtcgagg gtgaagaggg agttcgttag tggagtgttg

961 agggcgctgc ttgcgaagct ggggaagtgg gaggcgttgg tggatttggt gccggaggtc

1021 cgggaggata ggctgcgcag ggagaccatc gtgattgggg cggcggcgag gggggagtta

1081 cggcagacgt tgggggacag cggaggccat aattatcgga catattggac ggattgtgtg

1141 gtagtcccgg gagtggatct caaggtattt gtctgcgagt cccaacttcc ccccaactgt

1201 ggccgaatcc tcgccacgca aaggccgggg ccagaggact tcctggccga cgtcatgagc

1261 tacggggagg gccgctaccc gtacggtgag gccgagcccg gcttcaaacc ggaaatgggg

1321 acggatctga agcagcgagc cagtatgagg cagtgtgtct accatgccca gctagcctac

1381 cgtgcccgca tcgaccacgg cgaattgtac cactataccg gatacggctg cctctacggc

1441 ttgctcggac cactccgcaa gggtgatcac gtgagtgtca aattcgacgg cgcggcagat

1501 attggattcc tgctgtacgg ccgcatgtac ccggtgatta cgtctgtcga taatctgatg

1561 acctgcgact ttgtcgggca gccaactccc gtgggtcggt ggttccacag tgagaagtgg

1621gccctagagg gtccggttgc aaacgccgcc gtcccctccc tagtggattt aaacggcttg

1681acgcaagtgg ggcaaatggt ttaa

经检测，该酶在pH3.5～6.5的条件下酶活稳定，对淀粉等的水解效果良好。目前市场上现有的普通真菌α-淀粉酶的作用pH一般为5.2～5.6，当pH低于5.0时大量失活，同这些普通真菌α-淀粉酶相比，本发明所提供的真菌α-淀粉酶作用pH更宽，可达到耐酸性要求，因此其工业应用也更为广泛，适合作为一种新型耐酸性真菌α-淀粉酶进行应用。

本发明还提供了包含上述新型耐酸性真菌α-淀粉酶基因NTaAMY的重组载体，优选为NTaAMY-pPICzαA。将本发明的新型耐酸性真菌α-淀粉酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的真菌α-淀粉酶基因NTaAMY插入到质粒pPICzaA上的EcoR I和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒NTaAMY-pPICzαA。

本发明还提供了包含上述新型耐酸性真菌α-淀粉酶基因NTaAMY的重组菌株，优选重组菌株是毕赤酵母X33。

本发明还提供了一种高效表达上述新型耐酸性真菌α-淀粉酶基因NTaAMY的方法，包括以下步骤：

1）用上述的重组载体转化毕赤酵母感受态细胞X33，得到重组菌株NTaAMY-pPICzαA-X33；

2）采用筛选获得的重组菌株在25L发酵罐中进行发酵培养，诱导该真菌α-淀粉酶表达；以及

3）发酵结束后，回收并纯化所表达的该真菌α-淀粉酶进行相关测试。

其中，重组菌株在发酵罐中的发酵过程可分为3个阶段：

第一阶段为菌体培养阶段，按10%比例接入种子，培养20-24小时，以流加完葡萄糖或甘油为标志；

第二阶段为饥饿阶段，流加葡萄糖或甘油结束后，当溶氧上升至80%以上即表明该阶段结束，为期约30-60min；

第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20%以上，整个培养时间为180小时左右。

发酵结束后，发酵液可通过陶瓷膜或超滤膜进行后处理。利用本发明的方法高效表达上述的新型耐酸性真菌α-淀粉酶，可达到2500U/mL左右的发酵水平，与国内目前的现有技术相比，本发明的新型耐酸性真菌α-淀粉酶通过高效表达后能够达到较高的发酵水平，大大缩短了我国在真菌α-淀粉酶方面同世界领先水平的差距。

附图说明

图1新型重组耐酸性真菌α-淀粉酶在25L罐中的发酵过程曲线；

图2新型重组耐酸性真菌α-淀粉酶的最适反应温度；

图3新型重组耐酸性真菌α-淀粉酶的最适反应pH值；

图4新型重组耐酸性真菌α-淀粉酶的热稳定性曲线；

图5新型重组耐酸性真菌α-淀粉酶的pH稳定性曲线；

图6各种离子对新型重组耐酸性真菌α-淀粉酶酶活力的影响。

具体实施方式

以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》（第三版）J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生化材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实验材料和试剂：

1、菌株与载体

大肠杆菌Topl0、毕赤酵母X33、载体pPICzαA均购自Invitrogen公司。

2、酶与试剂盒

逆转录酶SuperScript^TMIII、RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司。质粒DNA提取试剂盒，胶回收试剂盒，PCR纯化试剂盒购自上海生工公司。限制性内切酶购自Fermentas公司。

3、培养基

基本盐培养基：磷酸二氢铵5%、磷酸二氢钾0.5%、七水硫酸镁1.5%、硫酸钾1.95%、硫酸钙0.1%、氢氧化钾0.1%、消泡剂0.03%。高压后每升加4.35毫升PTM1

微量无机盐溶液（PTM1）：硫酸铜0.6%、碘化钾0.018%、一水硫酸锰0.3%、二水钼酸钠0.02%、硼酸0.002%、六水氯化钴0.05%、氯化锌2%、七水硫酸铁6.5%、浓硫酸0.5%、生物素0.02%

实施例1、产真菌α-淀粉酶黑曲霉菌株的诱变、培养

将原产真菌α-淀粉酶的黑曲霉菌株AN0921（菌种保藏编号ACCC30132）在PDA平板上进行培养，然后采用等离子体（ARTP）、紫外线、硫酸二乙酯（DES）进行单独及复合诱变处理，筛选获得一株真菌α-淀粉酶突变株TaAN0921。

对该突变株进行发酵培养，其发酵培养基组成如下：

蛋白胨2%、酵母粉0.5%、糊精10%、谷氨酸钠1.5%、磷酸二氨钾0.15%、硫酸镁0.10%

以上发酵培养基于121℃、0.1MPa下灭菌30min，冷却后接种，于30℃、200rpm条件下培养4～5天。

发酵结束后，取适量酶液进行测试，检测结果表明，该真菌α-淀粉酶作用pH为3.5～6.5，大大优于目前市场上现有的普通真菌α-淀粉酶，为一种优良的耐酸性真菌α-淀粉酶，具有良好的应用前景。

由于筛选得到的突变菌株TaAN0921生长较为缓慢，且真菌α-淀粉酶的产酶水平较低，因此需对该菌种进行相应改造，以提高其生产真菌α-淀粉酶的性能。

实施例2、黑曲霉（TaAN0921）α-淀粉酶基因的克隆

按照逆转录酶SuperScript^TMIII Reverse Transcriptase的操作说明，采用RNA提取试剂盒，提取黑曲霉（TaAN0921）的总RNA，合成第一链cDNA。以cDNA为模板，设计引物进行PCR扩增，并将PCR产物进行EcoRI和NotI双酶切，然后与经过同样酶切的毕赤酵母表达载体pPICzαA相连接，连接产物转化大肠杆菌Topl0感受态细胞，经抗生素Zeocin筛选后，获得阳性克隆。提取阳性克隆的质粒并进行测序。测序结果表明，克隆得到的DNA插入片段含有真菌α-淀粉酶基因完整的开放阅读框。该真菌α-淀粉酶基因（NTaAMY）全长1704bp，编码567个氨基酸，得到的重组表达载体命名为NTaAMY-pPICzαA。

扩增所用引物如下：

NTaAMY5EcoRI：

5’TACCAGAATTCTCCCAATTCATAGAGTGCAAAGCC3’

NTaAMY3NotI：

5’CGAAGCGGCCGCTTAAACCATTTGCCCCACTTGCGT3’

实施例3、包含新型耐酸性真菌α-淀粉酶基因NTaAMY的毕赤酵母工程菌构建

将上述重组表达载体（NTaAMY-pPICzαA）采用SacI进行线性化，线性化后的重组载体电击转化毕赤酵母X33，电转化后涂布于含Zeocin的YPD平板上进行筛选，得到毕赤酵母重组菌株NTaAMY-pPICzαA-X33。

实施例4、新型耐酸性真菌α-淀粉酶菌株的高效表达

对筛选获得的新型耐酸性真菌α-淀粉酶重组菌株NTaAMY-pPICzαA-X33进行高密度液体发酵培养。

配制10L基本盐培养基，在25L液体发酵罐中灭菌后，冷却至常温。用氨水调节发酵液的pH值为4.60，接入1L液体种，发酵温度设定为30℃，调节转速和空气流量控制溶氧大于20%以上。

整个发酵过程分3个阶段：

第一阶段为菌体培养阶段，流加已灭菌的2L50%的葡萄糖或甘油，培养20-24小时，流加葡萄糖或甘油完后结束；

第二阶段为饥饿阶段，葡萄糖或甘油流加完之后，当溶氧上升至80%以上、pH上升即表明该阶段结束，为期约30-60min；

第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20%以上，培养时间在180小时左右。

在发酵过程中的定时取样测定酶活，发酵过程中新型耐酸性真菌α-淀粉酶的表达情况如附图1所示，发酵180h的发酵液酶活为2524U/mL。

实施例5、新型耐酸性真菌α-淀粉酶的酶活力检测

酶活单位定义：1mL酶液或1g固体酶粉在40℃、pH5.0的条件下，反应30min，产生相当于10mg葡萄糖的还原糖所需的酶量，即为1个真菌α-淀粉酶活力单位。

实施例6、新型耐酸性真菌α-淀粉酶的性质测定

1、最适反应温度测定

分别吸取2%的可溶性淀粉20mL于若干试管中，加入磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液5mL摇匀，在不同温度的恒温水浴锅中预热5min，再加入稀释好的酶液1mL，反应结束后检测酶活，以最高酶活力为100%，其它温度下测得的酶活与之相比，即得到该温度下的相对酶活。

该新型耐酸性真菌α-淀粉酶的最适反应温度曲线见图2，其最适反应温度为50℃。

2、最适反应pH测定

配制不同pH值的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，用不同pH值缓冲液配制2%的可溶性淀粉作为反应底物。分别吸取各pH条件下配制好的可溶性淀粉20mL于若干试管中，加入相对应pH的缓冲液5mL摇匀于40℃恒温水浴锅中预热5min，反应结束后检测酶活，并采用最高酶活为100%，其他检测结果与之相比，即得到不同pH检测条件下的相对酶活。

该新型耐酸性真菌α-淀粉酶最适反应pH曲线见图3，其最适反应pH为5.5左右。

3、新型耐酸性真菌α-淀粉酶的热稳定性测定

按照真菌α-淀粉酶的检测方法，将酶液稀释适当倍数，在不同温度下处理30min后，以未处理酶液的酶活力为对照100%，测定该新型耐酸性真菌α-淀粉酶的相对酶活。

该新型耐酸性真菌α-淀粉酶的热稳定性测定结果见图4。

结果显示该新型耐酸性真菌α-淀粉酶的热稳定性能较好，在60℃以下较稳定，温度超过70℃后则酶活损失较大。

4、新型耐酸性真菌α-淀粉酶pH稳定性测定

将稀释后的酶液与不同pH的缓冲液混合，常温下放置1h，以未处理酶液的酶活力为对照100%，测定该新型耐酸性真菌α-淀粉酶的相对酶活。

该新型耐酸性真菌α-淀粉酶的pH稳定性检测结果见图5。

结果显示该新型耐酸性真菌α-淀粉酶在pH2.0～8.0范围内稳定，pH低于2.0及pH高于8.0时，则失活较大。

5、各种离子对新型耐酸性真菌α-淀粉酶活力的影响

将含有1mM Fe²⁺、Fe³⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Cu²⁺的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液与稀释适当倍数的酶液混合，室温放置1h，以未处理的酶液为对照，结果如图6所示。

结果表明，Ca²⁺对酶活有较明显的激活作用；Fe²⁺、K⁺、Mg²⁺Zn²⁺、Mn²⁺对酶活性影响不大；Fe³⁺、Co²⁺、Cu²对酶活性则有一定程度的抑制作用。