在转基因水稻种子里表达细菌α-淀粉酶和真菌葡萄糖淀粉酶

摘要

本论文研究了利用转基因水稻大规模生产低成本α-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的技术。这两个淀粉酶在工业上应用非常广泛，降低生产成本具有重大经济价值。利用农杆菌转化方法，分别筛选获得到了这两个淀粉酶的转基因水稻株系。对这几个转化株系的分析表明这两个酶在水稻种子里得到了很高的表达。 将来自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的α-淀粉酶基因(EC3.2.1.1)经过密码子优化改造后与水稻种子储藏蛋白Gt1启动子一起克隆于pCAMB1300载体中，得到了含有能够在种子中特异表达的α-淀粉酶基因的双元载体pCAMB1300-GT1-AMY75。采用农杆菌侵染法与粳稻(Oryza sativa L.ssp.japonica)秀水11愈伤共培养进行转化，对分化得到的植株进行分子鉴定显示α-淀粉酶基因已整合进水稻基因组中。对表达α-淀粉酶的TO代水稻分析发现α-淀粉酶在种子中获得了大量积累。酶的表达对米质有一定程度的影响，但是对种子的重量没有显著的影响。T0代转基因水稻种子进行酶活性分析显示75-23株系酶活性最高，约为15000 Units/g(1 Unit定义为在70℃以淀粉为底物每分钟产生1 μmol的还原性末端所需的酶量)。酶的最适pH值为5.0～5.5，最适温度为70℃，但是在90℃时仍保持有相当部分酶活性。模仿工业发酵过程，对种子里表达的α-淀粉酶的液化能力进行了测定。结果显示，表达α-淀粉酶的75-23的水稻种子粉只需要以1:100的比例与玉米淀粉混合，就能够很短时间内将玉米淀粉完全液化。表达α-淀粉酶的水稻种子粉也能很好地液化粗玉米粉或粗水稻粉。 根据丝状真菌(Aspergillus awamori)的葡萄糖淀粉酶基因的序列(gi:134058186)，经过密码子优化改造后人工合成了该酶的基因，将其与水稻种子储藏蛋白Gt1启动子功能性地连接并克隆于pCAMB1300载体中，得到了双元载体pCAMB1300-GT1-BG17。同样采用农杆菌侵染法转化了粳稻(Oryza sativaL.ssp．japonica)秀水11。对转化得到的植株进行了分子鉴定，结果显示葡萄糖淀粉酶基因已整合进水稻基因组中。对表达葡萄糖淀粉酶的TO代水稻种子分析发现，酶的表达对种子的重量没有显著影响，但对米质有一定程度的影响。T0代转基因水稻种子中酶活性发分析显示，株系bg17-2葡萄糖淀粉酶的酶活性约为530 units/g(1 unit定义为在60℃以淀粉为底物每分钟产生1μmol的还原性末端所需的酶量)。种子中的葡萄糖淀粉酶最适pH值为5.0，最适温度为60℃。 模仿工业生产葡萄糖过程对酶糖化能力进行测定，结果显示，表达葡萄糖淀粉酶的水稻种子粉在与玉米淀粉干重比为1:25的比例下，反应16小时能将液化后的玉米淀粉几乎全转变为葡萄糖。 本研究表明，在不需要任何外源酶的情况下，表达α-淀粉酶的水稻种子粉与表达葡萄糖淀粉酶的水稻种子粉能够一起完成玉米淀粉的液化和糖化的全过程，并且由于这两种酶的最适pH值相近，因此在液化后不需要调pH值就能直接进行糖化反应。水稻种子中这两个淀粉酶的活性达到了工业运用的水平。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩写与中英文对照

致谢

第一章文献综述

1淀粉和淀粉酶

1.1淀粉

1.2淀粉降解和转化酶类

2α-淀粉酶家族及其在工业上的应用

2.1 α-淀粉酶家族的结构和性质

2.2 α-淀粉酶家族在工业上的应用

3生物乙醇

3.1传统能源的弊端

3.2生物能源的兴起

3.3燃料乙醇

4转基因农作物

4.1转基因农作物的发展

4.2分子农业

4.3转基因技术在生物能源研究中的应用

5研究目的和意义

第二章材料与方法

1材料

1.1植物材料

1.2菌株和质粒

1.3试剂与仪器

1.4实验用溶液的配制

2方法

2.1 PCR技术

2.2 PCR产物纯化

2.3 DNA克隆技术

2.4重组质粒的提取与鉴定

2.5农杆菌感受态的制备和转化

2.6植物总DNA提取(CTAB法)

2.7Southern印迹分析

第三章细菌α-淀粉酶基因在转基因水稻中的表达

1材料与方法

1.1材料

1.2植物总DNA提取

1.3载体构建

1.4水稻的转化

1.5转细菌α-淀粉酶基因水稻的PCR鉴定

1.6转细菌α-淀粉酶基因水稻的Southern blot分析

1.7活性胶鉴定细菌α-淀粉酶在水稻种子里的表达

1.8表达细菌α-淀粉酶的水稻种子性质分析与测定

1.9水稻种子里表达的细菌α-淀粉酶液化能力的测定

2结果与分析

2.1载体的鉴定

2.2转细菌α-淀粉酶基因植株的获得

2.3转细菌α-淀粉酶基因植株的PCR鉴定

2.4转α-淀粉酶基因植株的Southern blot分析

2.5活性胶鉴定细菌α-淀粉酶在水稻种子里的表达

2.6表达细菌α-淀粉酶的水稻种子性质的分析与测定

2.7表达细菌α-淀粉酶的水稻种子液化能力的测定

3.讨论

第四章真菌葡萄糖淀粉酶基因在转基因水稻中的表达

1材料与方法

1.1材料

1.2植物总DNA提取

1.3载体构建

1.4水稻的转化

1.5转真菌葡萄糖淀粉酶基因水稻的PCR鉴定

1.6表达真菌葡萄糖淀粉酶的水稻种子性质的分析与测定

1.7表达真菌葡萄糖淀粉酶的水稻种子糖化能力的分析

2.结果与分析

2.1载体的鉴定

2.2转真菌葡萄糖淀粉酶基因植株的获得

2.3转真菌葡萄糖淀粉酶基因植株的PCR鉴定

2.4表达真菌葡萄糖淀粉酶水稻种子性质的分析与测定

2.5表达真菌葡萄糖淀粉酶的水稻种子糖化能力的分析

3.讨论

总讨论

参考文献

附录

博士研究生阶段发表与待发表的论文