用于检测转基因水稻T1C-19中外源基因的引物及检测方法

摘要

本发明涉及一种用于检测转基因水稻T1C-19中外源基因的引物，包含引物C1：序列为5’-cacgaaagagaagggcactc-3’，引物C2：序列为5’-tcccagataagggaattaggg-3’，和引物C3：序列为5’-gcaactgtgttgtaggtatg-3’。本发明还提供了一种检测转基因水稻T1C-19中外源基因的方法，同时在一个PCR反应体系中用引物C1、C2和C3对待测材料基因组DNA进行多重PCR扩增，检测扩增产物带型。如果只能扩增出512bp片段，表明该水稻中

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测转基因水稻T1C-19中外源基因的引物及检测方法。 

背景技术

稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟是水稻的主要害虫，其危害会造成叶片枯白、枯心苗、白穗，瘪谷大量增加，严重影响水稻产量。转Bt毒蛋白基因水稻对稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟具有良好的抗性，种植Bt水稻既可以有效避免稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟对水稻的危害，又可以减少杀虫剂的使用，减轻环境污染。水稻科学家们已经培育出一些列的转Bt基因水稻 (Tu et al., 2000; Ye et al., 2001; Chen et al., 2005; Tang et al., 2006)，这些Bt水稻为培育抗螟虫水稻新品种提供了种质资源。 

T1C-19是一个转cry1C基因水稻新品系，对稻纵卷叶螟、二化螟和三化螟具有良好的抗性（Tang et al., 2006；Zheng et al., 2011），是进行抗虫水稻育种的良好亲本。利用T1C-19作为抗虫基因供体，以优良常规水稻品种（品系）作受体进行杂交（回交），在选育过程中利用分子标记对抗虫基因进行跟踪，从而选育出抗螟虫的优良水稻新品种（品系）。 

目前所用的检测cry1C基因的分子标记主要是根据导入的外源基因片段序列设计的特异性显性标记（Tang et al., 2006；Yang et al., 2010），该标记只能检测目标基因的有无，不能区分杂合基因型和纯合基因型，需要在下一代对基因型进行验证，因此显性标记进行分子标记辅助育种效率低，耗费时力。因此，有必要针对T1C-19中的外源基因设计一个能区分杂合基因型和纯合基因型的共显性标记检测体系，在以T1C-19为亲本的抗虫水稻育种中跟踪抗虫基因，以提高育种效率。 

发明内容

本发明的目的是提供一个用于检测T1C-19及其衍生材料中的cry1C基因的PCR检测体系，利用该体系对水稻植株进行检测，可以判断该植株中cry1C基因的基因型。该体系可应用于分子标记辅助育种中对cry1C基因的检测。 

本发明提供的技术方案是：一个用于检测转基因水稻T1C-19中外源基因的引物，包含正向引物C1和反向引物C2或C3；其中：正向引物C1：序列为5’-cacgaaagagaagggcactc-3’，反向引物C2：序列为5’- tcccagataagggaattaggg - 3’， 反向引物C3：序列为5’- gcaactgtgttgtaggtatg -3’。 

本发明还提供了一种检测转基因水稻T1C-19中外源基因的的方法，同时在一个PCR反应体系中用正向引物C1和反向引物C2、C3，对T1C-19或其衍生的后代材料基因组DNA进行多重PCR扩增，检测扩增产物带型。如果只能扩增出一条512bp片段而没有386bp片段，表明该水稻中cry1C基因纯合；如果只能扩增出一条386bp片段而没有512bp片段，表明不具有cry1C基因；如果同时扩增出512bp片段和386 bp片段，表明该水稻中cry1C基因杂合。 

本发明正向引物C1位于T1C-19或其衍生的后代材料基因组中T-DNA左侧水稻基因组295-314bp；反向引物C3位于T1C-19或其衍生的后代材料基因组中 T-DNA右侧水稻基因组54-73bp，反向引物C2位于T1C-19或其衍生的后代材料基因组T-DNA左侧179-199bp。在有T-DNA插入的DNA链中，C1和C2扩增区域为512bp，C1和C3之间扩增区域大于5kb，在本专利所述PCR扩增体系和反应条件下没有扩增产物；在无T-DNA插入的DNA链中，C1和C2没有扩增产物，C1和C3扩增区域为386bp。 

所述PCR扩增体系为： 10×含Mg²⁺的PCR缓冲液1.5μl，2.5 mmol.L^-1 dNTP 1.2μl， Taq DNA聚合酶1U，T1C-19或其衍生的后代材料基因组DNA模板1μl，10 mol.L^-1的C1 0.5μl、10 mol.L^-1的C2 0.4μl、10 mol.L^-1的C3 0.2 μl，ddH₂O补足体积15μl。 

所述PCR反应条件为： 94℃预变性4min，94℃变性 40 s，55℃复性30 s，72℃延伸30 s，共30个循环；然后72 ℃延伸5 min。 

所述检测扩增产物带型的方法是进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，然后紫外凝胶成像系统照像。 

本发明利用上述引物对水稻基因组DNA进行扩增后，经0.8%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像系统照像检测。如果只能扩增出一条512bp片段，表明该水稻中cry1C基因纯合；如果只能扩增出一条386 bp片段，表明该水稻中不具有cry1C基因；如果同时扩增出512bp片段和386 bp片段，表明该水稻中cry1C基因杂合。 

附图说明

图1为三引物C1、C2和C3在T1c-19基因组中的示意图。C1在T-DNA插入位点的左侧水稻基因组序列中，为正向引物；C3在T-DNA插入位点的右侧水稻基因组序列中，为反向引物；C2在T-DNA中靠近左侧部分，为反向引物。 

图2为T1c-19基因组中T-DNA部分序列及插入位点两端的水稻基因组序列图。中间大写部分为T-DNA序列，左右两侧小写部分为插入位点两端水稻基因组序列，箭头所示为三引物C1、C2和C3所在序列位置。 

图3为二引物C1+C2、 C1+C3的PCR体系对水稻材料的扩增示意图。M：DL2000 Marker，1：T1C-19（转基因纯合体），2：9311/ T1C-19（转基因杂合体），3：R838/ T1C-19（转基因杂合体），4：宜恢72/ T1C-19（转基因杂合体），5：9311（非转基因材料），6：R838（非转基因材料），7：宜恢72（非转基因材料）。a：C1+C2引物体系的扩增结果，b： C1+C3引物体系的扩增结果。 

图4为二引物C1+C2、 C1+C3的PCR体系扩增产物测序结果图。a：C1+C2在T1C-19和9311/ T1C-19中扩增出的DNA片段序列。小写部分为T-DNA插入位点的侧翼序列，大写部分为T-DNA序列，横线部分分别为引物C1和C2位置。b：C1+C3在9311和9311/ T1C-19中扩增出的DNA片段序列。大写部分为T-DNA插入位点的左侧翼序列，小写部分为T-DNA插入位点的右侧翼序列，横线部分分别为引物C1和C3位置。 

图5为不同引物使用量的三引物PCR反应体系的扩增效果图。M：DL2000 Marker，泳道1-3分别为T1C-19、9311/ T1C-19、9311。体系1：0.5μl C1+0.4μl C2+0.4μl C3，体系2：0.5μl C1+0.4μl C2+0.3μl C3，体系3：0.5μl C1+0.4μl C2+0.2μl C3，体系4：0.5μl C1+0.4μl C2+0.1μl C3。 

图6为三引物PCR体系在转基因材料不同杂交组合中的验证图。M：DL2000 Marker，1：T1C-19（转基因纯合体），2：R83（非转基因材料），3：宜恢72（非转基因材料），4：R838/ T1C-19（转基因杂合体），5：宜恢72/ T1C-19（转基因杂合体）。 

具体实施方式

（1）水稻材料和试剂

转cry1C基因纯合系T1C-19由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室/国家植物基因研究中心（武汉）提供。非转基因水稻9311、辐恢838、宜恢72为普遍使用的水稻恢复系，分别由江苏下里河地区农科所、四川省原子核应用研究所和湖北省宜昌市农科院选育。如有研究需要，公众可以从材料培育单位获得。

以非转基因水稻9311、辐恢838、宜恢72为母本，T1C-19为父本进行杂交，获得cry1C基因杂合的F₁代，F₁代自交获得F₂代，在F₂代中随机选择10株进行3引物PCR检测，分别收获这10株自交种子种植成F₃代株系。 

DNA提取和PCR检测用试剂均购自Takara公司。 

（2）试验仪器设备

PCR仪：GeneAmp 9700型PCR仪

研磨仪：德国RETSCH MM301组织研磨仪

离心机：德国Sigma 1-14小离心机

电泳仪：美国Bio-Rad PowerPac 3000电泳仪

凝胶分析系统：美国Bio-Rad Gel Doc XR+ 凝胶成像系统

其它仪器：天平、恒温水浴锅、冰箱等

（3）DNA提取

取约1-2cm长的水稻幼嫩叶片置于2ml圆底离心管中，加入2×CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）400 μl后在样品研磨仪中磨碎匀浆，置60℃水浴20min，加入400 μl氯仿/异戊醇（24:1）震荡混匀10min，10000rpm离心10min，取200μl上清置于另一加有400μl 95%预冷乙醇的1.5ml离心管，静置10min，13000rpm离心10min，弃上清后晾干，加入50μl灭菌的超纯水溶解。

（4）三引物设计

在T1C-19中T-DNA左侧水稻基因组序列（GenBank: HQ161062.1）295-314bp处设计一条正向引物C1，序列为5’-cacgaaagagaagggcactc-3’；在T-DNA序列右侧水稻基因组序列54-73bp处设计一条反向引物C3，序列为5’- gcaactgtgttgtaggtatg -3’；在靠近左侧水稻基因组T-DNA179-199bp处设计一条反向引物C2，序列为5’- tcccagataagggaattaggg - 3’。T-DNA的插入位点和引物位置见图1，T-DNA的侧翼序列见图2。根据设计，在非转基因水稻中，C1+C3扩增出一条386bp的PCR产物；在转基因纯合体中C1+C2扩增出一条512bp的PCR产物，由于T-DNA序列过长，C1+C3没有扩增产物。在转基因杂合体中同时扩增出386bp和512bp的2条带。引物利用Premier 3软件设计，由上海生工生物科技有限公司合成。

（5）二引物PCR检测

为了检测二引物体系的扩增特异性，以不同类型水稻材料DNA为模板，分别利用引物C1+C2和C1+C3进行扩增。PCR反应体系为15μl ，其中包含10×PCR 缓冲液（含Mg²⁺） 1.5μl，2.5 mmol.L^-1 dNTP 1.2μl， Taq DNA聚合酶1U，DNA模板1μl，10 mol.L^-1 引物C1 、C2（或者C1、C3）使用量分别为0.2μl。PCR 反应程序为94℃预变性4min；94℃变性 40 s，55℃复性30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。

结果见图3。C1+C2在转基因纯系T1C-19、转基因杂合体9311/ T1C-19、R838/ T1C-19、宜恢72/ T1C-19中扩增出一条约512bp的片段，在非转基因材料9311、R838、宜恢72中没有扩增产物（图3a）。C1+C3在转基因纯系T1C-19中没有产物，在转基因杂合体9311/ T1C-19、R838/ T1C-19、宜恢72/ T1C-19，以及非转基因材料9311、R838、宜恢72中扩增出一条约386bp的片段（图3b）。该结果与设计的扩增产物大小一致。 

（6）PCR产物测序及序列分析

为了进一步验证二引物体系扩增产物是否为目标基因序列，对引物C1+C2和C1+C3在9311、T1C-19和9311/ T1C-19中扩增出的片段进行测序。PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳分离后，切割包含目标片段的胶块，用上海生工生物工程技术有限公司生产的DNA胶回收试剂盒回收目标片段DNA，送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。测序结果见图4。C1+C2在T1C-19和9311/ T1C-19中扩增出的DNA片段序列完全一致（图4a）。对该序列进行BLAST分析，结果表明该序列与引物设计时所用的GeneBank（HQ161062.1）中的T1C-19的基因组序列相同，其中小写部分为T-DNA插入位点的侧翼序列，大写部分为T-DNA序列。C1+C3在9311和9311/ T1C-19中扩增出的DNA片段序列也完全一致，见图4b。BLAST分析表明，该片段来自于水稻第11染色体组（GeneBank：AC123519.2），且与T1C-19的T-DNA插入位点的侧翼序列相同，其中大写部分为T-DNA插入位点的左侧翼序列，小写部分为T-DNA插入位点的右侧翼序列。测序结果表明，引物C1+C2和C1+C3的扩增结果与设计一致，均扩增出目标片段。

（7）三引物体系的优化

三引物体系中存在1个上游引物和2个下游引物，引物之间的竞争会影响扩增效果。为此，利用转基因纯系T1C-19、转基因杂合体9311/ T1C-19和非转基因材料9311基因组DNA为模板，设计了4个不同引物使用量的PCR反应体系。体系1：0.5μl C1+0.4μl C2+0.4μl C3，体系2：0.5μl C1+0.4μl C2+0.3μl C3，体系3：0.5μl C1+0.4μl C2+0.2μl C3，体系4：0.5μl C1+0.4μl C2+0.1μl C3。PCR反应体系为15μl ，其中包含10×PCR 缓冲液（含Mg²⁺） 1.5μl，2.5 mmol.L^-1 dNTP 1.2μl， Taq DNA聚合酶1U，DNA模板及以上体系的引物量（C1、C2和C3的浓度为10 mol.L^-1）。PCR 反应程序为94℃预变性4min；94℃变性 40 s，55℃复性30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min。

由图5看出，4个PCR反应体系均能区分转基因杂合体、转基因纯合体和非转基因材料，T1C-19、9311及杂合体9311/ T1C-19中扩增出清晰的片段，片段大小分别与T1C-19和9311中的片段大小一致。体系3的扩增效果最好，表现在杂合体两条片段的扩增量几乎一致。 

（8）三引物PCR体系在T1C-19后代材料中的应用实例

利用优化后的PCR扩增体系3对，对非转基因水稻R838、宜恢72及其杂种R838/ T1C-19和宜恢72/ T1C-19进行检测，结果见图6。在T1C-19中扩增出一条512bp的片段，在R838、宜恢72中分别扩增出一条386bp片段，在R838/ T1C-19和宜恢72/ T1C-19中同时扩增出512bp和386bp的两条片段。检测结果表明，在这些材料中该体系同样可以准确地区分转基因杂合体、转基因纯合体和非转基因材料。

收获9311/ T1C-19、R838/ T1C-19和宜恢72/ T1C-19种子，种植成F₂代。在9311/ T1C-19、R838/ T1C-19和宜恢72/ T1C-19的F₂代植株中分别随机取10株，利用PCR扩增体系3进行检测，检测结果显示，在F₂代中出现了转基因杂合、转基因纯合和转基因阴性单株的分离（表1）。收获这10株的种子种植成F₃代株系，每个株系取20株进行三引物PCR检测。检测结果表明，来自F₂代转基因纯合和转基因阴性单株的F₃家系目标基因稳定，仍为转基因纯合和转基因阴性基因型，而来自F₂代转基因杂合单株的F₃家系中目标基因发生分离，出现转基因杂合、转基因纯合和转基因阴性单株。以上结果表明，利用该三引物PCR体系可以准确地鉴定出T1C-19及其衍生的后代材料中转基因杂合、转基因纯合和转基因阴性植株。 

表1利用三引物体系对F₂代和F₃代材料的PCR检测结果 

注：RR表示转基因纯合体，Rr表示转基因杂合体，rr表示转基因阴性。

优点效果

目前所用的检测T1C-19及其衍生的后代材料中cry1C基因的分子标记主要是根据导入的外源基因片段序列设计的特异性显性标记（Tang et al., 2006；Yang et al., 2010），该标记只能检测目标基因的有无，不能区分杂合基因型和纯合基因型，需要在下一代对基因型进行验证，因此显性标记进行分子标记辅助育种效率低，耗费时力。利用本发明设计的C1、C2、C3三引物PCR检测体系，对T1C-19及其衍生的后代材料基因组DNA进行多重PCR扩增，在非转基因中扩增出一条386bp片段，在转基因纯合体中扩增出一条512bp片段，在转基因杂合体中同时扩增出386bp和512bp片段（图5、图6）。一次PCR反应即可区别出转基因杂合、转基因纯合和转基因阴性三种基因型。运用该体系在分子标记辅助育种中对植株的基因型进行检测，可以提高对植株的选择效率，加快抗螟虫水稻新品种的培育。 

<110>湖北省农业科学院粮食作物研究所

 

<120>用于检测转基因水稻T1C-19中外源基因的引物及检测方法

 

<160>3

 

<210>1

 

<211>20

 

<212>DNA 

 

<213>人工序列

 

<220>

 

 

<400>1

 

     cacgaaagagaagggcactc

 

 

<210>2

 

<211>21

 

<212>DNA 

 

<213>人工序列

 

<220>

 

 

<400>2

 

      tcccagataagggaattaggg

 

 

<210>3

 

<211>20

 

<212>DNA 

 

<213>人工序列

 

<220>

 

 

<400>3

 

     gcaactgtgttgtaggtatg