转基因水稻中Bt蛋白ELISA检测方法的建立及检测

摘要

该实验的目的就是建立一套快速、有效、方便并且能够定量检测转基因水稻中Bt含量的方法.首先,用细菌中分离的纯品CryIA(e)蛋白作为抗原对新西兰白兔进行免疫,成功制备出了效价较高的CryIA(e)蛋白抗体,并且用戊二醛一步法对纯化的I gG进行了碱性磷酸酶标记.实验中进行了直接法、间接法和双抗夹心法等ELISA方法检测转基因水稻中Bt的含量,证明双抗夹心法是一种比较理想的方法;同时确定了双抗夹心法的各项具体条件.应用所建立的检测方法对大量的转基因水稻样品进行了Bt含量的检测.

目录

摘要

一、前言

1.1本研究的立题思想

1.2文献综述

1.2.1 Bt的分类

1.2.2 Bt的结构与功能

1.2.3转Pt基因植物发展概况

1.2.4转Bt基因抗虫植物所存在的问题

1.2.5水稻抗虫转基因研究现状

1.3 ELISA概述

二、材料与方法

2.1实验材料

2.2主要试剂

2.3主要仪器

2.4实验方法

2.4.1抗原制备

2.4.2兔的免疫

2.4.3抗血清的制备

2.4.4抗体的纯化

2.4.5抗体的酶标记

2.4.6样品可溶性蛋白提取

2.4.7 Bradford法测定样品中可溶性蛋白浓度

2.4.8直接法测定转基因水稻中Bt含量的方法

2.4.9间接法测定转基因水稻中Bt含量

2.4.10双抗夹心法测转基因水稻中Bt含量

2.4.11 ELISA测定数据的处理

三、结果与分析

3.1制备了高效价的CrylA(e)兔多抗

3.2所制备的抗体分析

3.2.1抗原抗体的免疫交叉反应

3.2.2抗体的特异性

3.3转基因水稻中Bt含量检测方法的确立

3.3.1直接ELISA法

3.3.2间接ELISA法

3.3.3双抗夹心法ELISA

3.4双抗夹心法ELISA条件的确立

3.4.1包被方法的确立

3.4.2可溶性蛋白提取方法的选择

3.4.3酶标抗体的浓度选择

3.4.4 Bt包被量的确定

3.4.5反应条件的确定

3.5双抗夹心法ELISA的重复性分析

3.5.1 ELISA重复性分析

3.5.2 Bt含量检测重复性分析

3.6应用双抗夹心法ELISA研究转基因水稻中Bt蛋白的表达

3.6.1转基因水稻中Bt含量与其抗虫性的关系

3.6.2转基因水稻中Bt含量的时空变化

四、讨论

4.1抗体的有效性

4.2检测方法的确立

4.3检测中需注意的问题

4.4转基因水稻中Bt含量与其抗虫性的关系

4.5转基因水稻中Bt基因表达的时空变化

4.6转基因水稻中Bt基因的沉默

4.7将来可以继续进行的研究

参考文献

附录

1、论文中所用Bt的氨基酸序列与DNA序列

1.1、CrylA(e)

1.2、CryIA(c)

2、论文中所需溶液的配制方法

3、IgG Purification Kit使用方法

4、底物试剂盒使用方法

5、转基因水稻中Bt含量与其抗虫性关系全部结果

致谢