大豆根瘤菌玻璃化冻存液及玻璃化冻存大豆根瘤菌的方法

摘要

大豆根瘤菌玻璃化冻存液及玻璃化冻存大豆根瘤菌的方法。它涉及一种微生物玻璃化冻存液及玻璃化冻存微生物的方法。它提供了一种含有乙二醇且化合物组成简单的大豆根瘤菌玻璃化冻存液及玻璃化冻存大豆根瘤菌的方法。大豆根瘤菌玻璃化冻存液由甘油、乙二醇、DMSO和蒸馏水组成。玻璃化冻存方法：将大豆根瘤菌菌液加入大豆根瘤菌玻璃化冻存液中；然后将大豆根瘤菌玻璃化冻存液投入液氮中快速玻璃化冻存。本发明用于微生物保存领域。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微生物玻璃化冻存液及玻璃化冻存微生物的方法。

背景技术

根瘤菌是一类生活在土壤中的革兰氏阴性杆状细菌，在合适的条件下根瘤菌能侵染豆科植物并与之进行共生结瘤固氮。据估计，根瘤菌所固定的氮约占生物固氮总量的65%,在农业生产中起着极其重要的作用。菌种资源是我国丰富的自然资源宝库的重要组成部分，随着生物学技术的不断发展，种质资源的利用对生命科学的研究起着越来越重要的作用，对菌种保藏技术也提出了越来越高的要求。为了使自然界分离得到的野生型菌种和人工选育得到的用于科学研究和工业生产等方面的优良菌种尽可能长时间地发挥作用，需采用各种适宜的方法妥善保存以保证菌种成活和遗传性状的稳定，使之不发生或尽可能少发生变异。因此，菌种保藏是一项重要的基础工作。

低温冷冻保存作为崭新的保存方法，日益受到人类的重视，其中玻璃化冷冻保存技术是一条简捷而很有潜力的方法。玻璃化冻存技术是指利用多种高浓度的冷冻保护剂联合形成的玻璃化冷冻保护液保护悬浮细胞，直接投入液氮进行冻存的方法，以该种方法冻结的细胞悬液没有冰晶的形成，直接液体转变为非晶态的固化过程。利用玻璃化方法在动、植物细胞保存中普遍获得成功，但在微生物保存领域极为少见；而且，现有玻璃化冻存液中所含成分繁多，除了水之外多数由5～6种化合物组成。由于乙二醇对动物有毒性，所以基本上都以聚乙二醇等作为玻璃化冻存液组成成分。

发明内容

本发明提供了一种含有乙二醇且化合物组成简单的大豆根瘤菌玻璃化冻存液及玻璃化冻存大豆根瘤菌的方法。

大豆根瘤菌玻璃化冻存液按质量百分比由28%～32%的甘油、12%～18%的乙二醇、12%～18%的DMSO和余量的蒸馏水组成。

利用上述大豆根瘤菌玻璃化冻存液玻璃化冻存大豆根瘤菌的方法按以下步骤进行：

将大豆根瘤菌菌液加入大豆根瘤菌玻璃化冻存液中，大豆根瘤菌菌液与大豆根瘤菌玻璃化冻存液的体积比为2:3；然后将大豆根瘤菌玻璃化冻存液投入液氮中快速玻璃化冻存；

大豆根瘤菌玻璃化冻存液按质量百分比由28%～32%的甘油、12%～18%的乙二醇、12%～18%的DMSO和余量的蒸馏水组成；

玻璃化冻存降温速度大于2000℃/min。

大豆根瘤菌还不同于其他微生物，其可产生相当量的胞外粘液，因此阻碍了目前已有玻璃化冻存液的冻存效果，导致大豆根瘤菌大量失活，存活率低；目前已有玻璃化冻存液冻存大豆根瘤菌，其保存1年后的存活率不足70%。本发明采用甘油、乙二醇和DMSO（二甲基亚砜）作为玻璃化冻存液，可以有效地穿透大豆根瘤菌的胞外粘液，从而对大豆根瘤菌进行玻璃化冻存。

经本发明玻璃化冻存的大豆快生根瘤菌及慢生根瘤菌菌株，保藏12个月后其菌株存活率均可达到85%以上，且固氮酶活性没有明显下降。本发明玻璃化冻存液及玻璃化冻存方法对大豆根瘤菌具有优异的保藏作用。

实验未发现经本发明玻璃化冻存的大豆根瘤菌有任何异常现象发生，说明玻璃化冻存液中的乙二醇对大豆根瘤菌无不良影响。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式大豆根瘤菌玻璃化冻存液按质量百分比由28%～32%的甘油、12%～18%的乙二醇、12%～18%的DMSO和余量的蒸馏水组成。

具体实施方式二：本实施方式大豆根瘤菌玻璃化冻存液按质量百分比由30%的甘油、15%的乙二醇、15%的DMSO和40%的蒸馏水组成。

具体实施方式三：本实施方式大豆根瘤菌玻璃化冻存液按质量百分比由29%的甘油、14%的乙二醇、14%的DMSO和43%的蒸馏水组成。

具体实施方式四：本实施方式大豆根瘤菌玻璃化冻存液按质量百分比由31%的甘油、14%的乙二醇、16%的DMSO和39%的蒸馏水组成。

具体实施方式五：本实施方式玻璃化冻存大豆根瘤菌的方法按以下步骤进行：

将大豆根瘤菌菌液加入大豆根瘤菌玻璃化冻存液中，大豆根瘤菌菌液与大豆根瘤菌玻璃化冻存液的体积比为2:3；然后将大豆根瘤菌玻璃化冻存液投入液氮中快速玻璃化冻存；

大豆根瘤菌玻璃化冻存液按质量百分比由28%～32%的甘油、12%～18%的乙二醇、12%～18%的DMSO和余量的蒸馏水组成；

玻璃化冻存降温速度大于2000℃/min。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式五的不同点是：将大豆根瘤菌培养至对数生长后期，再按比例加入大豆根瘤菌菌液玻璃化冻存液。其它步骤及参数与实施方式五相同。

具体实施方式七：本实施方式玻璃化冻存大豆根瘤菌的方法按以下步骤进行：

将大豆根瘤菌菌液加入大豆根瘤菌玻璃化冻存液中，大豆根瘤菌菌液与大豆根瘤菌玻璃化冻存液的体积比为2:3；然后将大豆根瘤菌玻璃化冻存液投入液氮中快速玻璃化冻存；

大豆根瘤菌玻璃化冻存液按质量百分比由30%的甘油、15%的乙二醇、15%的DMSO和余量的蒸馏水组成；

玻璃化冻存降温速度大于2000℃/min。

本实施方式对快生型根瘤菌——费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii）HN01和慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA110进行玻璃化冻存试验。

将大豆根瘤菌以5%的接种量转接YM液体培养基中培养（YM液体培养基由0.5gK₂HPO₄、10.0g甘露醇、0.2g MgSO₄·7H₂O、10g NaCl、1.0g酵母提取物和1000ml蒸馏水组成，并调整pH至7.0。），28℃培养备用。

采用系列稀释法测定大豆根瘤菌菌数：称取10ml大豆根瘤菌培养液加入90mL的无菌水中，静置20min，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，即成母液菌悬液。分别吸取5.0mL母液菌悬液加入45mL无菌水中，按1:10进行系列稀释，分别得到1:1×10¹，1:1×10²，1:1×10³，1:1×10⁴……稀释的菌悬液。取3个连续稀释度，分别吸取菌悬液0.1mL，涂布至预先制备好的YMA固体培养基平板上（YMA固体培养基由0.5g K₂HPO₄、10.0g甘露醇、0.2gMgSO₄·7H₂O、10g NaCl、1.0g酵母提取物、20g琼脂和1000ml蒸馏水组成，并调整pH至7.0。），于28℃条件下培养。以出现20～300个菌落数的稀释度的平板为计数标准，有效活菌数按计算：nv—体积有效活菌数，亿/mL；—菌落平均数，个；k—稀释倍数；v₁—母液菌悬液体积，mL；v₂—菌悬液加入量，mL；v₀—样品量，mL。

经本实施方式玻璃化冻存快生型根瘤菌（费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii）HN01）的菌株存活率如表1所示，试验分3次进行。

表1

经本实施方式玻璃化冻存慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA110的菌株存活率如表2所示，试验分3次进行。

表2

通过以上菌株存活率试验数据可以看出，在玻璃化冻存后保存1年无论快生型大豆根瘤菌还是慢生型大豆根瘤菌在本实施方式玻璃化冻存条件下均可长时间保持较高的细胞存活率。特别是快生型大豆根瘤菌，细胞存活率达到94%以上。

经本实施方式玻璃化冻存后，将冻存活化后的菌株采用乙炔还原法测定固氮酶活性。

快生型根瘤菌（费氏中华根瘤菌（Sinorhizobium fredii）HN01）的菌株玻璃化冻存活化后的固氮酶活性如表3所示，试验分3次进行。

表3固氮酶活性（nmol/mg·h）

慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)USDA110的菌株玻璃化冻存活化后的固氮酶活性如表4所示，试验分3次进行。

表4固氮酶活性（nmol/mg·h）

实验数据表明经本实施方式玻璃化冻存后大豆根瘤菌的固氮酶活性没有明显下降，几乎维持其初始固氮酶活性水平，而两株菌株固氮酶活性之间的差异可能是因为慢生型大豆根瘤菌生长缓慢，导致其在相同时间内固氮酶活性低于快生型大豆根瘤菌。

本实施方式玻璃化冻存液及玻璃化冻存方法未改变大豆根瘤菌的基因序列以及基因调控因子，所以大豆根瘤菌菌株内的固氮酶基因可以正常表达。

试验未发现在玻璃化冻存过程中乙二醇对大豆根瘤菌菌株有毒副作用和影响。