公开/公告号CN103289978A
专利类型发明专利
公开/公告日2013-09-11
原文格式PDF
申请/专利权人 宁波优美肽生物科技有限公司;
申请/专利号CN201310192320.7
发明设计人 诸辉;
申请日2013-05-21
分类号C12N9/52;C12N15/81;C12R1/84;C12R1/425;
代理机构浙江永鼎律师事务所;
代理人王梨华
地址 315100 浙江省宁波市鄞州区首南街道萧皋西路199号
入库时间 2024-02-19 20:12:27
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2022-10-14
专利权质押合同登记的注销 IPC(主分类):C12N 9/52 授权公告日:20150617 申请日:20130521 专利号:ZL2013101923207 登记号:Y2021330001782 出质人:宁波希诺亚海洋生物科技有限公司 质权人:宁波天瑾创业服务有限公司 解除日:20220926
专利权质押合同登记的生效、变更及注销
2015-06-17
授权
授权
2015-06-10
专利申请权的转移 IPC(主分类):C12N9/52 变更前: 变更后: 登记生效日:20150518 申请日:20130521
专利申请权、专利权的转移
2013-11-13
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N9/52 申请日:20130521
实质审查的生效
2013-09-11
公开
公开
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,涉及一种基因重组毕赤氏酵母高表达发酵 生产舍雷肽酶的方法。
背景技术
舍雷肽酶属于蛋白分解酶,具有很强的溶解纤维蛋白块、消除黏性脓痰和 净化炎症病灶面等作用,临床广泛用于呼吸道疾病引起的排痰困难。舍雷肽酶 具有化痰、减轻炎症反应、消除水肿或肿胀的租用:其机制是通过降解异常渗 出物、变性蛋白质及纤维素凝块,使脓、痰、血凝块等液化变稀,易于引流排 出;促进血管、淋巴管对分解产物的吸收,从而改善炎症病灶的循环,消除脓 胀,促使肉芽组织新生,从而达到标本兼治之效果;减少缓激肽、肿瘤坏死因 子(TNF)等炎症介质的释放;并与抗生素有协同作用。本品对纤维蛋白、凝血 因子I有很强的溶解能力。
发明内容
本发明的目的是提供一种基因重组毕赤氏酵母高表达发酵生产舍雷肽酶的 方法,采用了巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)生产舍雷肽酶,本方法使用 了来源于沙雷氏菌的舍雷肽酶的基因,使用不同的培养方法和提取发酵方法。 通过基因克隆技术,巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中导入了舍雷肽酶基 因,使巴斯德毕赤氏酵母大量产生舍雷肽酶,基因构建后的重组舍雷肽酶质粒 具有甲醇诱导和高效表达的特征,可以实现高密度的高表达,实现工业化生产 舍雷肽酶。
为了解决上述技术问题,本发明通过下述技术方案得以解决:
基因重组毕赤氏酵母高表达发酵生产舍雷肽酶的方法,采用了巴斯德毕赤 氏酵母(Pichia pastoris)生产舍雷肽酶,从沙雷氏菌(SerratiaBizio)中克隆出 舍雷肽酶的基因,SER基因通过基因筛选技术,构建成PPIC9K-SER重组质粒, PPIC9K-SER重组质粒转化到毕赤氏酵母GS115Z中表达,然后筛选出高效表达 转化子,经甲醇诱导产生重组酶,制得舍雷肽酶。
作为优选,筛选出高效表达转化子时,挑阳性克隆单菌落接种于BMGY培 养基上摇床培养,离心收集菌体,用BMMY培养基重悬,至OD600≈1,再次挑 阳性克隆单菌落接种于BMGY培养基上摇床培养,离心收集菌体,用BMMY 培养基重悬,至OD600≈1继续摇床培养。
作为优选,BMGY培养基中含有少量酵母粉、甘油和生物素,按质量分数 计为酵母粉2-5%、甘油10-20%、生物素1-2%。
作为优选,摇床培养的条件为28℃-32C,250-350r/min培养至OD600= 2~6。
作为优选,经甲醇诱导产生重组酶时,每24h向培养基中添加无水甲醇至 终浓度为1%,培养48h,检查容氧率为18-23%之间,离心收集上清液,通过 膜浓缩,经冷冻真空干燥制成粉状的舍雷肽酶。
作为优选,用于浓缩的膜的分子量为30000。
本发明提供了一种基因重组毕赤氏酵母高表达发酵生产舍雷肽酶的方法, 采用了巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)生产舍雷肽酶,本方法使用了来源 于沙雷氏菌的舍雷肽酶的基因,使用不同的培养方法和提取发酵方法。通过基 因克隆技术,巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中导入了舍雷肽酶基因,使 巴斯德毕赤氏酵母大量产生舍雷肽酶,基因构建后的重组舍雷肽酶质粒具有甲 醇诱导和高效表达的特征,可以实现高密度的高表达,实现工业化生产舍雷肽 酶。在生物医药技术领域具有良好的应用前景。
附图说明
图1为添加甲醇诱导后舍雷肽酶发酵活性的示意图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例
基因重组毕赤氏酵母高表达发酵生产舍雷肽酶的方法,采用了巴斯德毕赤 氏酵母(Pichia pastoris)生产舍雷肽酶,从沙雷氏菌(SerratiaBizio)中克隆出 舍雷肽酶的基因,SER基因通过基因筛选技术,构建成PPIC9K-SER重组质粒, PPIC9K-SER重组质粒转化到毕赤氏酵母GS115Z中表达,然后筛选出高效表达 转化子,经甲醇诱导产生重组酶,制得舍雷肽酶。
筛选出高效表达转化子时,挑阳性克隆单菌落接种于BMGY培养基上摇床 培养,离心收集菌体,用BMMY培养基重悬,至OD600≈1,再次挑阳性克隆单 菌落接种于BMGY培养基上摇床培养,离心收集菌体,用BMMY培养基重悬, 至OD600≈1继续摇床培养。
BMGY培养基中含有少量酵母粉、甘油和生物素,按质量分数计为酵母粉 2-5%、甘油10-20%、生物素1-2%。
摇床培养的条件为28℃-32C,250-350r/min培养至OD600=2~6。
如图1所示:甲醇诱导产生重组酶时,每24h向培养基中添加无水甲醇至 终浓度为1%,培养48h,检查容氧率为18-23%之间,离心收集上清液,通过 膜浓缩,经冷冻真空干燥制成粉状的舍雷肽酶。
用于浓缩的膜的分子量为30000。
总之,以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所作 的均等变化与修饰,皆应属本发明专利的涵盖范围。
机译: 酵母巴斯德毕赤氏酵母的重组菌株-合成基因编码的分泌型热木聚糖酶的生产者,以及基于该菌株的微生物合成分泌型热木糖苷酶的方法
机译: 巴斯德毕赤氏酵母生产的重组蠕虫疫苗以及蠕虫疫苗的蛋白质生产和纯化工艺
机译: 用巴斯德毕赤氏酵母生产重组牛磺酸金枪鱼生长激素