用于扩增核糖核酸的方法及分析该方法中RNA或DNA模板的方法

摘要

本发明提供了用于扩增核糖核酸的方法及分析该方法中RNA模板的方法，开发了一种RNA-PAP的新方法，其可以直接放大RNA模板而无需额外的处理；RNA-PAP为扩增RNA模板带来了一个全新的机理，其中RNA依赖性DNA焦磷酸化反应和RNA依赖性DNA聚合反应是用3'末端阻断性寡核苷酸引物所串联耦合的，由于这种串连耦合，使得RNA-PAP对RNA模板的不匹配性具有高度的选择性，从而提供了高度特异性的RNA模板的扩增；此外，经遗传工程产生的突变体聚合酶具有更高的RNA依赖性DNA焦磷酸化反应和RNA依赖性DNA聚合反应的效率。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其是用于扩增核糖核酸的方法及分析该 方法中RNA或DNA模板的方法。

背景技术

一、PAP技术用于DNA模板的扩增

焦磷酸化激活的聚合反应是一种使用3'末端阻断性寡核苷酸引物使得 DNA聚合酶的焦磷酸化反应串联耦合聚合反应的核酸扩增方法。其引物在3' 末端被不可延伸的核苷酸,例如双脱氧核苷酸,所封闭（3'末端阻断剂）,因而 不能直接被DNA聚合酶所延伸。当3'末端被阻断的引物与其互补性DNA模 板退火时，在焦磷酸的存在下DNA聚合酶可以从3'末端被阻断的引物上去除 其3'末端阻断剂，这一反应为焦磷酸化反应。然后DNA聚合酶即而能延伸 DNA模板上已去除3'末端阻断剂的引物。这些在美国专利6534269，7033763， 7105298，7238480，7504221，7914995，和7919253中已有所描述。

在PAP（焦磷酸化激活的聚合反应）中使用3'末端被阻断的寡核苷酸引 物而串联耦合了焦磷酸化反应和聚合反应导致了非常高的选择性，因为一个 显著的可导致假阳性的非特异性扩增（第二类错误）需要不匹配性焦磷酸化 反应加上随即发生的不匹配性延伸反应,而这种串联错误事件的发生概率估 计为3.3×10^-11。

使用两个相反方向的3'末端被阻断的寡核苷酸引物并在其3'末端与一个 核苷酸相互重叠，这种双向形式的PAP（双向PAP）则特别适合于等位基因 的特异性扩增。在10⁹个拷贝的野生型DNA存在的条件下，双向-PAP能够实 验出单一拷贝的突变型等位基因而没有假阳性扩增。

PAP的最初测试是使用了Tfl和Taq聚合酶并用于人类多巴胺D1基因 DNA模板，从而证明了DNA依赖性DNA焦磷酸化反应和DNA依赖性DNA 聚合反应可以串联耦合。在用于其它DNA模板的情况下，使用一个经基因工 程改造而含F667Y突变的聚合酶TaqFS，证明可大大提高PAP的效率。

然而没有任何证据表明PAP可以利用RNA作为模板，这是一个长久以来 想到但却尚没有解决了的需求。利用RNA作为模板并使得PAP工作还需要 RNA依赖性DNA聚合反应和RNA依赖性DNA焦磷酸化反应，而后者的可 行性在此之前还没有被证实过。

二、RNA依赖性DNA聚合反应或RT-PCR中使用的反转录

RT-PCR的第一个步骤是由RNA依赖性DNA聚合酶或逆转录酶所催化的以 RNA为模板的DNA聚合反应或引物延伸反应。禽成髓细胞瘤病毒（AMV） 和莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶是在常温下使用的逆转录病毒转录 酶，通常在该第一步骤中用来将RNA模板转换成它的互补DNA（cDNA） 产物。尤其是在二价离子Mn²⁺的存在下,Taq酶，一个耐热性的DNA聚合酶， 具有低度可测性的逆转录酶活性。另一个耐热性DNA聚合酶rTth虽然有非 常相似的氨基酸序列,但是有超过Taq酶100倍以上的逆转录酶活性。此外， Taq和rTth聚合酶也可经基因工程改造以提高其逆转录酶活性。

三、依赖于RNA的DNA焦磷酸化反应

Taq，Tfl，TaqFS，Pfu，和Vent聚合酶都可催化DNA依赖性DNA焦磷酸化 反应。也有报道称艾滋病毒及丙型肝炎病毒的逆转录酶可催化DNA依赖性 DNA焦磷酸化反应，可以在人工化学合成的DNA（而不是RNA）模板上去 除其DNA引物的3'末端的双脱氧核苷酸。

然而从没有RNA依赖性的DNA焦磷酸化反应，既用RNA为模板并除去 寡核苷酸引物上的3'末端脱氧核糖核苷酸，3'末端双脱氧核苷酸，或3'末端无 环核苷酸的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供用于扩增核糖核酸的方法，即以核 糖核酸（RNA或DNA）为模板焦磷酸化激活的聚合反应（RNA-PAP或 DNA-PAP）的方法，可以直接放大RNA模板或DNA模板，通过使用3'末端 被阻断性寡核苷酸引物将RNA依赖性DNA焦磷酸化反应和RNA依赖性 DNA聚合反应串联耦合或将DNA依赖性DNA焦磷酸化反应和DNA依赖性 DNA聚合反应串联耦合，该方法带来了一个以RNA或DNA为模板扩增核酸 的新机制。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供分析上述方法中RNA模板的方 法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

用于扩增核糖核酸的方法，是以RNA或DNA为模板合成核酸的 RNA-PAP或DNA-PAP方法，包括以下具体步骤：

（a）一个3'末端被阻断的寡核苷酸引物即其3'末端有一个不可延伸的 核苷酸（3'末端阻断剂）,并与其互补的RNA模板或DNA模板产生退火；

（b）RNA依赖性DNA焦磷酸化反应或DNA依赖性DNA焦磷酸化反 应以去除3'末端被阻断引物的阻断剂,从而使其成为3'末端去除阻断的引物；

（c）RNA依赖性DNA聚合反应或DNA依赖性DNA聚合反应来延伸其 3'末端已去除阻断的引物。

优选的，上述用于扩增核糖核酸的方法（RNA-PAP方法或DNA-PAP方 法），其步骤（a）、（b）和（c）可以重复进行直到达到核酸产物所预期的水平。

优选的，上述用于扩增核糖核酸的方法（RNA-PAP方法或DNA-PAP方 法），在反应中可以更进一步加入第二个寡核苷酸引物，即：在步骤（c）后，

（d）该第二引物可与步骤（c）的核酸产物产生退火；

（e）DNA依赖性DNA聚合反应来延伸该第二引物从而可以达到一个指 数性的扩增。

优选的，上述用于扩增核糖核酸的方法（RNA-PAP方法或DNA-PAP方 法），可以更进一步包括第二个3'末端被阻断的寡核苷酸引物，即：在步骤（c） 后，

（f）第二3'末端被阻断的引物与步骤（c）的核酸产物产生退火；

（g）DNA依赖性DNA焦磷酸化反应则从被阻断引物上去除3'末端阻断 剂,产生一个3'末端去除阻断的引物；

（h）DNA依赖性DNA聚合反应对3'末端已去除阻断的引物进行延伸。

优选的，上述用于扩增核糖核酸的方法（RNA-PAP方法或DNA-PAP方 法），所述步骤（b）和（c）由聚合酶催化。

优选的，上述用于扩增核糖核酸的方法（RNA-PAP方法或DNA-PAP方 法），步骤（b），（c），（d），（f），（g）和（h）都是在一个反应试管中由同一 聚合酶所催化的。

优选的，上述用于扩增核糖核酸的方法（RNA-PAP方法或DNA-PAP方 法），所述聚合酶是经过遗传工程优化的DNA聚合酶，根据所述SEQ ID NO： 10，可在与野生型Taq聚合酶相对应的由TaqFS，TaqFS681G，TaqFS681K， TaqFS681V，TaqFS681Y，TaqFS608V681G，TaqFS599V602A605A608V681G， 和TaqFS742S747I所构成的一组突变体酶中进行选择。

优选的，上述用于扩增核糖核酸的方法（RNA-PAP方法或DNA-PAP方 法），根据所述SEQ ID NO：10,经遗传工程优化的突变体聚合酶可在与野 生型Taq聚合酶相对应的599V，602A，605A，608V，667Y，681G，681K， 681V，681R，742S，和747I位点氨基酸突变的一组突变体中选择。

优选的，上述用于扩增核糖核酸的方法（RNA-PAP方法或DNA-PAP方 法），根据所述SEQ ID NO：10,经遗传工程优化的突变体聚合酶可在与野生 型Taq聚合酶相对应的其氨基酸突变点位于599，602，605，608，667，681， 742，和747的一组突变体中选择。

优选的，上述用于扩增核糖核酸的方法（RNA-PAP方法或DNA-PAP方 法），所述焦磷酸化反应中dNTP的浓度为10-50μM。

优选的，上述用于扩增核糖核酸的方法（RNA-PAP方法或DNA-PAP方 法），所述焦磷酸化反应中dNTP浓度为10-25μM。

分析上述方法中RNA模板的方法，步骤包括：

（a）RNA模板与其互补的寡核苷酸引物发生退火；

（b）经由RNA依赖性DNA焦磷酸化反应从引物上去除其3'末端核苷酸。

优选的，上述分析上述方法中RNA模板或DNA模板的方法，所述引物 在其3'末端带有一个不可延伸的核苷酸。

优选的，上述分析上述方法中RNA模板或DNA模板的方法，所述步骤 （b）后进一步包括：（c）延伸3'末端非延伸性引物。

优选的，上述分析上述方法中RNA模板或DNA模板的方法，所述RNA 依赖性DNA焦磷酸化反应的反应混合物包括有：（a）一种RNA模板，（b） 一个互补性寡核苷酸引物，以及（c）一种核酸聚合酶；（a’）一种DNA模 板，（b’）一个互补性寡核苷酸引物，以及（c’）一种核酸聚合酶

优选的，上述分析上述方法中RNA模板的方法，所述反应混合物中的核 酸聚合酶是I型DNA聚合酶。

优选的，上述分析上述方法中RNA模板的方法，所述反应混合物中的核 酸聚合酶是经过遗传工程优化的DNA聚合酶，根据所述SEQ ID NO：10，可 在与野生型Taq聚合酶相对应的由TaqFS，TaqFS681G，TaqFS681K， TaqFS681V，TaqFS681Y，TaqFS608V681G，TaqFS599V602A605A608V681G， 和TaqFS742S747I所构成的一组突变体酶中进行选择。

优选的，上述分析上述方法中RNA模板的方法，所述反应混合物中的核 酸聚合酶根据所述SEQ ID NO：10,经遗传工程优化的突变体聚合酶可在与 野生型Taq聚合酶相对应的599V，602A，605A，608V，667Y，681G，681K， 681V，681R，742S，和747I位点氨基酸突变的一组突变体中选择。

优选的，上述分析上述方法中RNA模板的方法，所述反应混合物中的核 酸聚合酶根据所述SEQ ID NO：10,经遗传工程优化的突变体聚合酶可在与 野生型Taq聚合酶相对应的其氨基酸突变点位于599，602，605，608，667， 681，742，和747的一组突变体中选择。

本发明的有益效果是：

本发明所述用于扩增核糖核酸的方法（RNA-PAP方法或DNA-PAP方法）， 可以直接放大RNA模板或DNA模板而无需额外的处理；此外，RNA-PAP对 不匹配的RNA模板具有高的选择性,DNA-PAP对不匹配的DNA模板具有高 的选择性,从而提供了高度特异性的RNA模板或DNA模板的扩增；而且经基 因工程改造的突变体聚合酶具有更高的RNA-PAP或DNA-PAP效率。

附图说明

图1阐明了RNA-PAP的原理。寡核苷酸引物在其3'末端被阻断，例如用 一双脱氧核苷酸来阻断它被聚合酶所延伸。当3'末端被阻断的引物与其互补的 RNA模板产生退火时，其3'末端双脱氧核苷酸可被RNA依赖性DNA焦磷酸 化反应所去除。已去除阻断的DNA引物可被以RNA为模板的RNA依赖性 DNA聚合酶所延伸；

图2说明了RNA依赖性DNA聚合反应的最佳dNTP浓度。RT-PCR实 验II（A至D）和III（E到H）在25μl的反应体积中加入了0.25ng的总量 RNA。每一种Taq聚合酶使用了一个单位（A和E），rTth（B和F），TaqFS （C和G），和TaqFS742S747I（D和H）。扩增曲线示图显示了所给周期的循 环次数和SybrGreen的荧光单位。

图3显示了在使用各种聚合酶的情况下RNA-PAP的可行性。RNA-PAP 实验IV（A至D），V（E到H），和VI（I到L）均为对0.25ng总量RNA的 扩增结果。每一验测均对TaqFS（A，E，I），TaqFS681G（B，F，J），TaqFS681K （C，G，K），TaqFS742S747I（D，H和L）聚合酶进行了测试。在25μl的 反应体积下，每一种酶的用量均是从1U直到1/16U的2倍方式连续性稀释。

具体实施方式

除非另有说明，本发明在具体实施时使用常用的化学，分子生物学，和 重组DNA等技术请详见如由Sambrook等人所著的“分子克隆”第2版 （Sambrook,J.F.,E.F.Maniatis,T..(1989).Molecular cloning,a laboratory  manual,second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, New York），Sambrook和Russell所著的“分子克隆”第3版（Sambrook,J.(2001). Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,Cold Spring Harbor  Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York），和Ausubel等人所著的“现 代分子生物学实验技术”（Ausubel,F.M.(1994).Current protocols in  molecular biology,John Wiley&Sons,New York）。

此外，除非另有定义，本发明所用的全部技术和科学术语是与在本领域 的普通技术人员所通常理解的术语含义是相同的：

PCR是指聚合酶链式反应。

RT-PCR是指反转录性聚合酶链式反应。

焦磷酸化反应是脱氧核糖核酸聚合反应的逆反应。在焦磷酸的存在下， 聚合酶可从双链DNA上将3'末端核苷酸去除而生成三磷酸核苷酸和缩短的双 链DNA：[dNMP]n+PPi→[dNMP]n-1+dNTP（Deutscher,M.P.,and Kornberg,A. (1969).Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid.28.The pyrophosphate  exchange and pyrophosphorolysis reactions of deoxyribonucleic acid polymerase. The Journal of biological chemistry244,3019-3028）。

DNA依赖性DNA焦磷酸化反应是指使用DNA为模板的DNA焦磷酸化 反应。它是DNA依赖性DNA聚合反应的逆反应。

RNA依赖性DNA焦磷酸化反应是指使用RNA为模板的DNA焦磷酸化 反应。它是RNA依赖性DNA聚合反应的逆反应。

聚合酶是指其具有催化聚合反应或延长脱氧核糖核酸的特性。

DNA依赖性DNA聚合酶是指具有催化以DNA为模板的DNA聚合反应 的特性。

RNA依赖性DNA聚合酶或逆转录酶是指具有催化以RNA为模板的DNA 聚合反应的特性。

3'末端阻断性寡核苷酸引物是指其带有3'末端非延伸性核苷酸（3'末端阻 断剂）如双脱氧核苷酸的寡核苷酸。其3'末端核苷酸不能被直接延伸，但它 可以被焦磷酸化反应所去除，已去除阻断的引物可以被聚合酶所延伸。

PAP是指焦磷酸化反应激活的聚合反应。

RNA-PAP是指以RNA为模板的PAP。

cDNA是指以RNA为模板所合成的互补性DNA分子。

热稳定是指一种酶，其具有热稳定性或热抵抗性。

蛋白突变是指在某一蛋白质位点的氨基酸残基的改变，如Taq聚合酶。 氨基酸残基的改变则被定义为与其相对的自然生成性蛋白质而言。一个蛋白 具有突变则被称作为“突变体”蛋白质。

除非另有说明，氨基酸的位点应该被解释为所有DNA聚合酶相类似的位 置，即使单个字母的氨基酸代码特别相指在Taq聚合酶上标示位置的氨基酸 残基。

实施例1

材料和方法

寡核苷酸引物的制备

3'末端被阻断的引物系由Integrated DNA Technologies公司进行化学合成 及HPLC纯化，引物均为30个核苷酸长和并在其3'末端用ddCMP双脱氧核苷 酸所阻断。一般DNA引物的合成也由同一供应厂商合成（表1）。

表1引物和实验列表

^a为避免来自于被污染的基因组DNA所产生的非特异性扩增，RT-PCR和 RNA-PAP的引物设计在跨越内含子区域的转录序列(mRNA)并能与其产生退 火。

^b例如P53是指人类P53基因；（13280）是指根据GenBank登录x54156,引 物的5'末端开始于第13280位点的核苷酸；D是指下游（即转录方向）。ACTB 基因是来自于GenBank登录NM_001101.3。GAPDH基因的mRNA来自从 GenBank登录AB062273.1。准确的PCR片段的大小和位置都可以从其信息化 的名称中获得。

^c基于其化学合成的可用性，以ddC双脱氧核苷酸为例。

总量RNA的提取：

总量RNA是根据Qiagen公司的实验技术步骤（QIAamp RNA血液迷你手 册）使用QIAamp RNA试剂盒从血液中的白细胞所提取。在此操作中使用无 RNA酶的DNA酶来去除污染的基因组DNA。用分光光度计在260nm处测 定总量RNA的浓度。质量是以A260/A280比值位于1.8和2.1之间来控制的。 提取的总量RNA储存在-20℃直至使用。

重组体质粒的构建：

野生型Taq聚合酶的氨基酸序列如同在GenBank登录AAA27507.1（SEQ  ID NO：10）中的描述。自氨基末端残基开始计数。字母是指其所示位置的氨 基酸残基的单字母氨基酸代码。

编码野生型Taq聚合酶的序列重组体质粒的构建是根据Navagen公司pET 质粒系统用户手册，由一个GenBank登录J04639从121到2619核苷酸，2.4kb 长的DNA片段联结至pET14b载体的Nde I与BamHⅠ限制性切点之间。然 后将重组体质粒转化到DH5α大肠杆菌细胞内提取其质粒DNA。连接后的Taq DNA聚合酶的编码序列则由ABI公司的Sanger荧光测序分析所证实。

使用Stratagene公司QuikChange引物设计软件所设计的用于诱发突变的寡 核苷酸引物和QuikChange闪电位点定向突变诱发试剂盒，按照Stratagene公 司的用户手册，共构建了八个编码突变型Taq聚合酶的重组体质粒。然后每 个突变体质粒转化到DH5α大肠杆菌细胞内并继而提取其质粒DNA。突变体 质的DNA序列是由ABI公司的Sanger荧光测序分析所证实。

突变体TaqFS含有G46D和F667Y氨基酸突变，TaqFS681G含有G46D， F667Y和E681G突变，TaqFS681K含有G46D，F667Y和E681K突变，TaqFS681V 含有G46D，F667Y和E681V突变，TaqFS681Y所含G46D，F667Y和E681Y 突变，TaqFS608V681G含有G46D，608V，F667Y和E681G突变， TaqFS599V602A605A608V681G含有G46D，I599V，E602A，L605A，A608V， F667Y和E681G突变，TaqFS742S747I含有G46D，F667Y，E742S，和M747I 突变。每一突变是由一个字母/数字/字母组合的型式来表示。字母是单个字 母氨基酸残基的代码。数字则表示基于SEQ ID NO：10的氨基酸序列中突变 位点氨基酸残基的位置。

突变体聚合酶的表达和提取：

根据BioLabs公司的手册,突变型Taq聚合酶是经转化到T7表达型lysY/ I^q大肠杆菌细胞来表达的。在Taq聚合酶的起始密码子之前，有六联组氨酸标 记的残基并与Taq聚合酶共同表达。由于表达的聚合酶含有组氨酸标记的N- 末端，按照Qiagen公司的Ni-NTA亲和层析方法进行纯化。从500毫升IPTG 诱导的大肠杆菌LB培养物中，纯化聚合酶的典型产量是4毫克。纯化蛋白的 SDS-PAGE分析在考马斯亮蓝染色后显示一个约95,000道尔顿的主带，纯度 ≥90％。

在-20℃下，酶存储于含有20mM Tris-HCl（在25℃下的pH为8.0），100mM KCl，0.1mM EDTA，50％甘油，0.5％Tween-20，和0.5％NP-40的存储缓冲液 中直至使用。

PCR校准DNA依赖性DNA聚合酶的活性：

试验1的寡核苷酸引物是设计用来扩增人类P53基因外显子6中一个209 bp的区域。每个PCR混合物含其总体积为25μl，含有50mM KCl，10mM的 Tris-HCl（在25℃下的pH值8.3），1.5mM Mg₂Cl，200μM每种dNTPs（dATP， dTTP，dGTP，和dCTP），0.1μM每种引物，0.1×SybrGreen I染料，0.02％ Tween-20，0.02％NP-40，20ng基因组DNA，和不同单位的聚合酶。

使用了一个Bio-Rad公司的CFX96实时PCR检测系统来对扩增产物进行 定量。分析模式：SybrGreen荧光，基线设置：基线减去曲线拟合，阈值循环 （C_t）测定：单阈值，基线方法：SYBR自动计算，阈值设置：自动计算。

循环含有94℃变性15秒，55℃退火30秒，和72℃延伸1分钟共30个循 环。在热循环前，使用一个94℃2分钟的步骤来对基因组DNA进行完全变性。

Taq聚合酶（Roche公司）被用来作为标准对于活性进行校准，在25微升 的反应体积内其用量为从1U直到1/16U的2倍方式连续稀释。为了进行比较， 其他的酶也以相同的方式进行稀释。以30圈内有可计量C_t值最小单位聚合酶 来反映其DNA依赖性DNA聚合酶的活性。

随继温度从68℃升到95℃，每次增加值为0.5℃并持续5秒,熔点曲线分 析用来确认扩增的产物。

除非另有说明，25μl的RT-PCR反应混合液中含有浓度为880mM Tris-HCl （在25℃下的pH值8.0），10mM（NH₄）₂SO₄，1.2mM MgCl₂，25μM dNTPs （dATP，dTTP，dGTP和dCTP），0.1μM实验II或III的各种寡核苷酸引物， 90μM Na₄PPi，0.1×SybrGreen I染料，0.02％Tween-20，0.02％NP-40，1U聚 合酶，和0.25ng的总量RNA模板。

使用了一个Bio-Rad公司的CFX96实时PCR检测系统来对扩增产物进行 定量。分析模式：SybrGreen荧光，基线设置：基线减去曲线拟合，阈值循环 （C_t）测定：单阈值，基线方法：SYBR自动计算，阈值设置：自动计算。

循环含有96℃12秒，60℃30秒，64℃30秒，和68℃30秒共30个循环。 在第一个循环前加了一个96℃2分钟的变性步骤。

随继用从68℃到95℃，增加值为0.5℃并持续5秒的熔点曲线分析来确认 扩增的产物。

为了进一步确认，将产物在一个标准的3％琼脂糖凝胶上进行电泳。用溴 化乙锭对凝胶进行染色并用一个电荷耦合器件(CCD)相机在UV下照相。

RNA-PAP：

除非另有说明，25μl的PAP反应混合液中含有浓度为880mM Tris-HCl （pH值8.0,25°C），10mM（NH4）₂SO₄，1.2mM MgCl₂，25μM dNTPs（dATP， dTTP，dGTP和dCTP），0.1μM实验IV,V,或VI的各种寡核苷酸引物，90μ M Na₄PPi，0.1×SybrGreen I染料，0.02％Tween-20，0.02％NP-40，各种不同 单位的聚合酶，和0.25ng的总量RNA模板。

使用了一个Bio-Rad公司的CFX96实时PCR检测系统来对扩增产物进行 定量。分析模式：SybrGreen荧光，基线设置：基线减去曲线拟合，阈值循环 （C_t）测定：单阈值，基线方法：SYBR自动计算，阈值设置：自动计算。

循环含有96℃12秒，60℃30秒，64℃30秒，和68℃30秒共30-35个循环。 在第一个循环前加了一个96℃2分钟的变性步骤。

随继用从68℃到95℃，增加值为0.5℃并持续5秒的熔点曲线分析来确认 扩增的产物。

为了进一步确认，将产物在一个标准的3％琼脂糖凝胶上进行电泳。用溴 化乙锭对凝胶进行染色并用一个电荷耦合器件(CCD)相机在UV下照相。

实施例2

RNA依赖性DNA聚合反应的最优条件

RT-PCR的方法包括两个步骤：1）RNA模板逆转录成cDNA产物，和2） 常规PCR对cDNA产物的扩增。一般认为在整个过程中逆转录是反应效率受 限制的步骤。

在逆转录反应中通常使用AMV或MMLV逆转录酶以及Taq，Tth聚合酶 和它们的经遗传工程改造的形式,另外每种dNTP的浓度为200μm。在RT-PCR 中，该浓度的dNTPs是适合于逆转录步骤和其随后的PCR步骤。然而它严重 地抑制了焦磷酸化¹。因此必需探索最佳的dNTP浓度。

为了寻找最佳的反应条件，设计了II和III两个RT-PCR实验（表1）。 RT-PCR实验II用寡核苷酸引物ACTB(426)25D和ACTB（488）25U扩增了一 个63bp的ACTB基因mRNA区域,及实验III用引物ACTB(426)25D和ACTB （705）25U扩增了一个280bp的ACTB基因mRNA区域。每一实验包含正 向引物和反向引物,而其反向引物则与RNA模板相匹配。

首先，检测在二价离子Mg²⁺存在下各种不同dNTP浓度的影响。在图2 中25μM每种dNTP及90μM PPi，25μM每种dNTP但不含PPi，以及200μM dNTP不含PPi共三种dNTP条件下进行了测试。在25μl的反应中，四种聚合 酶如Taq酶，rTth，TaqFS和Taq681G均为加一个单位。DNA依赖性DNA 聚合反应中的聚合酶活性是在标准的PCR条件下根据从人类基因组DNA中 扩增P53基因外显子6（PCR实验Ⅰ）的一个209-bp区域的结果而确定,并根 据Taq酶（Roche公司）的活性而进行校正的。此外，一个单位的Taq DNA 聚合酶的酶量则定义为在30分钟内及75℃下将10nmol dNTP结合至酸不溶 性物质内（Roche公司）。在RT-PCR实验II和III中，发现每种dNTP在25μ M的浓度下其RNA依赖性DNA聚合酶的活性要高于在200μM的浓度下。因 此25μM，而不是200μM，的每种dNTP则被用于随后的试验。

其次，检测各种不同聚合酶量的影响。共对TaqFS，TaqFS681G， TaqFS681K，TaqFS681V，TaqFS681Y，TaqFS608V681G， TaqFS599V602A605A608V681G，和TaqFS742S747I八个聚合酶进行了测试。 各酶的用量是在25μl的反应中，从1U直到1/16U的两倍方式连续稀释（表2）。 在30个循环内可测出最小单位的C_t值的聚合酶则被认为反映其相应水平的 RNA依赖性DNA聚合反应的活性，因为它是限制反应全过程的原因。发现 八个酶均表现出不同水平的RNA依赖性DNA聚合酶活性。

另外，在熔化曲线分析中只有一个熔融峰显示了所扩增产物的T_m值（实 验II的T_m=80.5-82°C以及实验III的T_m=89.5-90℃）。无模板的阴性对照组没 有显现出任何可测性的C_t值。

实施例3

RNA-PAP反应

RNA-PAP的过程可以分为两个步骤。在第一步中以RNA作为起始模板， RNA依赖性DNA焦磷酸化反应去除被阻断寡核苷酸引物上的3'末端阻断剂， 然后RNA依赖性DNA聚合反应延伸3'末端已去除阻断的引物而产生DNA 产物。在第二步中则以DNA产物作为模板，DNA依赖性DNA焦磷酸化反应 去除被阻断引物上的3'末端阻断剂，然后DNA依赖性DNA聚合反应延伸3' 末端已去除阻断的引物。因此共涉及四个不同的反应，它们均为经由聚合酶 所催化。

为证明原理，设计三种从RNA模板扩增的RNA-PAP实验：IV，V，和 VI（表1）。每一检测均有一个正向寡核苷酸引物和一个反向引物以便测定指 数性扩增。在3'末端被一个双脱氧核苷酸所阻断的反向引物与RNA模板相匹 配。

对于每一检测则使用了TaqFS，TaqFS681G，TaqFS681K，TaqFS681V， TaqFS681Y，TaqFS608V681G，TaqFS599V602A605A608V681G，及TaqFS742S747I 共八个聚合酶。每种酶的用量是在25μl的反应中，从1U直到1/16U的两倍 方式连续稀释。

RNA-PAP实验IV用寡核苷酸引物ACTB(426)25D和ACTB（488）30U扩 增了一个63bp的ACTB基因的mRNA区域（表2，图3）。在第一步中，RNA 依赖性DNA焦磷酸化反应去除3'末端被阻断引物ACTB（488）30U上的3' 末端ddC双脱氧核苷酸,然后RNA依赖性DNA聚合反应延伸了已去除阻断 的引物共34个碱基。

RNA-PAP实验V用寡核苷酸引物ACTB(426)25D和ACTB（572）30U扩 增了一个147bp的ACTB基因的mRNA区域（表2，图3B）。在第一步中， RNA依赖性DNA焦磷酸化反应去除3'末端被阻断引物ACTB（572）30U上 的3'末端ddC双脱氧核苷酸，然后RNA依赖性DNA聚合反应延伸了已去除 阻断的引物共118个碱基。

RNA-PAP实验VI用寡核苷酸引物GAPDH（50）-30D和GAPDH（110） -30U扩增了GAPDH基因的mRNA的区域（表2，图3C）。在第一步中，RNA 依赖性DNA焦磷酸化反应去除了3'末端被阻断引物GAPDH（110）-30U上 的3'末端ddC双脱氧核苷酸，然后RNA依赖性DNA聚合反应延伸了已去除 阻断的引物共32个碱基。

在实验IV，V和VI中证明了RNA-PAP的原理,并特别证实了1）RNA 依赖性DNA焦磷酸化反应和2）的串行耦合RNA依赖性DNA焦磷酸化反应 和RNA依赖性DNA聚合反应的可行性。同时还发现了TaqFS681K， TaqFS681V，TaqFS681Y，TaqFS608V681G，和TaqFS742S747I共5个酶表现出 较高的活性，尤其是RNA依赖性DNA焦磷酸化反应。

此外在熔化曲线分析中，只有一个熔融峰显示了来自扩增产物的T_m值（实 验IV的T_m=80.5-81.5°C，实验V的T_m=87.5-88°C，和实验VI的T_m=82-83°C）。 无模板的阴性对照组没有显现出任何可测性的C_t值。

表2RT-PCR和RNA-PAP所需最小单位聚合酶

^a单位被定义为根据Taq酶活性所校准的DNA依赖性DNA聚合酶的活 性。

^b在25微升反应中，加0.25ng的总量RNA，酶的用量为从1U直到1/16U 的2倍方式连续稀释。以30个循环可计量的C_t值所需要最小单位的聚合酶 来记算。

^C在30个循环内无C_t值显示。

RNA依赖性DNA焦磷酸化反应与RNA依赖性DNA聚合反应

RNA-PAP过程可以分为两个步骤。在以RNA为起始模板的第一步中， RNA依赖性DNA焦磷酸化反应和RNA依赖性DNA聚合反应是由一个聚合 酶所催化的两个截然不同的反应

要显示它们的相对重要性，对RT-PCR和RNA-PAP的所需聚合酶的最小 单位进行比较（表3）。在RT-PCR实验II中，RNA依赖性DNA聚合反应自 3'末端寡核苷酸引物ACTB（488）25U上延伸了38个碱基。在另一方面，在 RNA-PAP实验IV中，RNA依赖性DNA焦磷酸化反应去除了3'末端被阻断引 物ACTB（488）30U上的3'末端ddC双脱氧核苷酸，然后RNA依赖性DNA 聚合反应将已去除阻断的引物共延伸了34个碱基。在RNA-PAP实验VI中， RNA依赖性DNA焦磷酸化反应去除了3'末端被阻断引物GAPDH（110）-30U 上的3'末端ddC双脱氧核苷酸，然后RNA依赖性DNA聚合反应将已去除阻 断的引物共延伸了32个碱基。

表3用于RT-PCR和RNA-PAP实验中所需的聚合酶最小单位比率

由于扩增子的长度较小，RT-PCR实验II和RNA-PAP实验IV或VI之间 中的最低所需比率表明在RNA依赖性DNA焦磷酸化反应和RNA依赖性 DNA聚合反应之间的相对重要性（表3）。对RNA-PAP而言，那些具有最小 单位比率为≥1的聚合酶是首选的，例如TaqFS681K。

上述RNA-PAP反应的原理如下：

本发明是一种以RNA为模板来合成所需核酸的RNA扩增方法（图1）。

该方法由下列步骤所组成：a）杂交：一个互补性3'末端被阻断的寡核苷 酸引物即3'末端带有一个不能被延伸的核苷酸（3'末端阻断剂）的引物与RNA 模板产生退火，b）RNA依赖性DNA焦磷酸化反应：从3'末端被阻断的引 物上去除其3'末端阻断剂，和c）RNA依赖性DNA聚合反应：将3'末端已去 除阻断的引物进行延伸以合成所需核酸（图1）。

该方法生成的单链互补性DNA（cDNA）或RNA/cDNA的双链体。在 步骤c之后该cDNA产物可以被进一步扩增，如用PAP或PCR的方法。

该方法可以使用一种聚合酶，其既可催化RNA依赖性DNA焦磷酸化反 应而又可催化RNA依赖性DNA聚合反应。

3'末端阻断剂包括但不限定于3'末端双脱氧核苷酸。也可以使用其他3'末 端阻断剂如无环核苷酸其用2-羟基乙氧基甲基集团替代了2’-脱氧呋喃核糖。

一生物标本中可能含有RNA分子，RNA可以是异质性的,而其中目标 RNA只占一小部分。

上述参照具体实施方式对该用于扩增核糖核酸的方法及分析该方法中 RNA或DNA模板的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可 按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变 化和修改，应属本发明的保护范围之内。