沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法

摘要

本发明公开了一种沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，旨在提供一种特异性好、灵敏度高、可与沙门氏菌感染宿主细胞的过程中分泌的内源性沙门氏菌效应蛋白SopB发生特异性结合的兔源多克隆抗体的制备方法。以沙门氏菌效应蛋白SopB全长氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的从N末端第29位至第168位共计139个氨基酸如SEQ ID NO:2所示的蛋白质序列为免疫原，采用常规多克隆抗体的制备方法制备抗血清；纯化抗血清，即得沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体。本发明的方法得到了沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体，有利于对沙门氏菌效应蛋白SopB的免疫印迹分析、免疫荧光染色激光共聚焦显微观察，以及人们对肠道致病菌感染机制的深入研究。

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的抗体及其制备方法，具体的说是一种沙门 氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法。

背景技术

沙门氏菌效应蛋白SopB是由沙门氏菌SPI-1Ⅲ型分泌系统分泌的一种由 561个氨基酸构成的蛋白质分子,是一种肌醇磷脂酶，是目前沙门氏菌分泌的效 应蛋白中研究最多，功能最多样化的一个蛋白。沙门氏菌效应蛋白SopB首先作 用于质膜，激活SH3-鸟核苷酸交换因子（SGEF），间接活化交换因子RhoG，从 而进一步激活肌动蛋白，诱导细胞骨架重排，促使沙门氏菌侵入宿主细胞。沙 门氏菌效应蛋白SopB能够激活原癌基因Akt₄₇₃的磷酸化，对细菌入侵介导的细 胞凋亡具有抑制作用，促进宿主细胞的存活，为沙门氏菌在宿主细胞中的存活 提供条件。同时，SopB通过招募RAB5和VPS34到SCV（Salmonella Containing  Vacuole,SCV），促进SCV在宿主细胞内的形成和成熟，这对沙门氏菌在宿主细 胞内的存活与复制具有重要的意义。此外，SopB能够激活宿主细胞蛋白激酶 Erk1/2，p38和JNK的磷酸化激活，调控细胞核内基因的转录和翻译等功能。

虽然不同类型的沙门氏菌基因组间存在DNA水平的差异,但通过序列分析 发现，在能够引起人类疾病的五大类沙门氏菌（如表1所示）中除了鸭沙门氏 菌基因组未测序以外，SopB广泛存在于其他不同类型的沙门氏菌中，而且蛋白 序列高度保守，足见其功能的重要性。因此，SopB的功能研究将为揭示沙门氏 菌的致病机理，以及寻找沙门氏菌性肠道疾病的治疗靶点具有重要的意义。

表1.沙门氏菌效应蛋白SopB在不同类型沙门氏菌中的分布

沙门氏菌效应蛋白SopB包括561个氨基酸，其中，N端1-181个氨基酸的 区域被发现是一个GTPase结合结构域，能够与宿主细胞中的Cdc42的Rho GTPase 结构域互作，进而调控宿主细胞细胞骨架的重排和质膜内陷，帮助沙门氏菌的 成功侵染。C端是具有肌醇磷脂酶活性的结构域，能够直接催化4,5-二磷酸磷 脂酰肌醇去磷酸化生成5-磷酸肌醇，作为第二信使调控细胞骨架的重排。我们 曾经在肠上皮细胞中异位表达沙门氏菌效应蛋白SopB，结果发现大量的细胞出 现了死亡，说明沙门氏菌效应蛋白SopB对宿主细胞是有害的。因此不能够用沙 门氏菌效应蛋白SopB的全蛋白作为免疫抗原。

经对国内外的公司以及实验室的抗体进行检索发现，到目前为止，尚未有 沙门氏菌效应蛋白SopB的相应的抗体。经对文献进行检索发现，尚未有与沙门 氏菌效应蛋白SopB抗体制备相关的研究报道。沙门氏菌效应蛋白SopB抗体的 缺失限制了人们对沙门氏菌效应蛋白SopB进行免疫印迹分析、免疫组化分析以 及双重免疫激光共聚焦的显微观察等研究，影响到了人们对沙门氏菌感染机制 的深入研究以及抗感染药物的研发。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高、可与沙门氏菌感染宿主细 胞的过程中分泌的内源性沙门氏菌效应蛋白SopB发生特异性结合的兔源多克隆 抗体的制备方法。

本发明是通过以下的技术方案实现的：

一种沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

步骤一，以沙门氏菌效应蛋白SopB全长氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的 从N末端第29位至第168位共计139个氨基酸如SEQ ID NO:2所示的蛋白质序 列为免疫原，采用常规多克隆抗体的制备方法制备抗血清；

步骤二，纯化抗血清，即得沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体。

所述的沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

步骤1，克隆编码沙门氏菌效应蛋白SopB N末端第29位至168位共计139 个氨基酸的蛋白的如SEQ ID NO:9所示的SopB29-168核酸片段；

步骤2，将步骤1得到的SopB29-168核酸片段和pSUMO表达载体分别酶切 后构建第一连接体系，转化大肠杆菌，筛选pSUMO-SopB29-168重组质粒；利 用所得的pSUMO-SopB29-168重组质粒转化大肠杆菌，培养，融合蛋白的诱导， 裂解，挂镍柱，Ulp1酶切，纯化后，得沙门氏菌效应蛋白SopB29-168；

步骤3，以步骤2所得沙门氏菌效应蛋白SopB29-168为免疫原，采用常规 多克隆抗体的制备方法制备抗血清，利用HiTrap NHS-activated HP亲和层析 柱纯化抗血清，即得沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体。

步骤1中，所述克隆所用引物对具体为SEQ ID NO:10所示的上游引物和SEQ ID NO:11所示的下游引物。

步骤2中，所述构建的第一连接体系由1μl BamHl和XhoI酶切后的pSUMO 表达载体、7.5μl BamHl和XhoI酶切后的所述SopB29-168核酸片段、1μl 10×连接酶缓冲液和0.5μl T4DNA连接酶组成，连接条件是16℃连接过夜； 所述筛选pSUMO-SopB29-168重组质粒的过程为：将所述第一连接体系转化至 大肠杆菌DH5α中，使用含有34μg/ml卡那霉素的LB平板，37℃下培养12-16h， 随机挑取4个单克隆接种于5ml含有34μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中， 在37℃下培养过夜，提取质粒并用BamHl和XhoI双酶切鉴定，选取重组质粒测 序，测序正确的即为所需的pSUMO-SopB29-168重组质粒。

步骤2中，所述培养的过程为：将所述pSUMO-SopB29-168重组质粒转化 至大肠杆菌BL21(DE3)后，过夜培养后挑取单克隆至5ml含有34μg/ml卡那霉 素的LB液体培养基中，在37℃下培养过夜；将所得过夜培养物接种至1L含有 34μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃培养2.5-3h，至大肠杆菌 BL21(DE3)的OD₆₀₀值为0.6-0.8之间。

步骤2中，所述融合蛋白的诱导具体为：在上述OD₆₀₀值为0.6-0.8之间的 大肠杆菌BL21(DE3)培养液中加入诱导剂异丙基-Β-D-硫代吡喃半乳糖苷 （Isopropylβ-D-1-Thiogalactopyranoside，IPTG），使诱导剂的终浓度 为0.1mmol/L，在22℃下振荡诱导培养12h。

步骤2中，所述裂解具体为：将上述1L诱导后的大肠杆菌BL21(DE3)培养 液离心收集菌体，用50ml第一裂解缓冲液重悬，所述第一裂解缓冲液的组成为 50mmol/L Tris-HCl,内含500mmol/L氯化钠、20mmol/L咪唑、1mmol/L苯 甲基磺酰氟和0.2μmol/L细菌蛋白酶抑制剂混合物cocktail3（Protease Inhibitor Cocktail3Bacteria),pH值为8.0;将重悬后的菌液在0℃冰水浴 中用功率为400w的超声波进行超声破碎，间歇破碎90次，每超声3秒，间隔 7s；将超声波破碎后的菌液于13200转/分钟的转速下离心30min，收集上清 液，所得上清液于0.45μm膜过滤后得到破碎的大肠杆菌上清液备用。

步骤2中，所述挂镍柱（Ni-NTA beads）的过程为：取2ml专门用于组氨 酸（His）标签蛋白纯化的镍柱，轻微离心后，吸去上清液，镍柱用等体积的所 述第一裂解缓冲液洗涤两次；将洗涤后的镍柱加入所述用0.45μm膜过滤后破 碎的大肠杆菌上清液中，于4℃轻微旋转混匀30min；用5倍体积的所述第一 裂解缓冲液润洗三次后，将挂有SUMO-SopB29-168融合蛋白的镍柱保存在1倍 体积的50mmol/L Tris-HCl,pH值为8.0的缓冲液中，待用。

步骤2中，所述Ulp1酶切具体为：将pET28a-Ulp1重组质粒转化至大肠杆 菌BL21(DE3)，过夜培养后挑取单克隆至5ml含有34μg/ml卡那霉素的LB液 体培养基中，在37℃下培养过夜。将所得过夜培养物接种至1L含有34μg/ml 卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃培养2.5-3h，至大肠杆菌BL21(DE3)的 OD₆₀₀值为0.6-0.8之间；在OD₆₀₀值为0.6-0.8的大肠杆菌BL21(DE3)培养液中加 入异丙基-Β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.1mmol/L，22℃下振荡诱导培 养12-16h；将1L诱导后的大肠杆菌BL21(DE3)培养液离心收集菌体，用50ml 第二裂解缓冲液重悬，所述第二裂解缓冲液为pH值为8.0的50mmol/L  Tris-HCl,内含500mmol/L氯化钠和20mmol/L咪唑；将重悬后的菌液在0 ℃冰水浴中用超声波破碎，400W功率间歇破碎100次，每超声3秒，间隔7s； 将超声波破碎后的菌液于13200转/分钟的转速下离心30min，收集上清液,所 得上清液用0.45μm膜过滤后得到Ulp1表达的破碎的大肠杆菌上清液备用； 取2ml镍柱轻微离心后吸去上清液，镍柱用等体积的所述第二裂解缓冲液洗涤 两次；将洗涤后的镍柱加入所述用0.45μm膜过滤后的Ulp1表达的破碎的大 肠杆菌上清液中，于4℃轻微旋转混匀30min；用5倍体积的所述第二裂解缓 冲液润洗三次后，用pH值为8.0、内含200mmol/L咪唑的50mmol/L Tris-HCl 作为缓冲液洗脱Ulp1蛋白酶；将所得Ulp1蛋白酶溶液按照体积比1:10的比例 加入到所述挂有SUMO-SopB29-168融合蛋白的镍柱溶液中，置于4℃冰箱中酶 切过夜；所述纯化过程为：将所得Ulp1蛋白酶酶切后的体系于4℃轻摇30min 后于2000转/分离心2min，收集上清液即获得初步纯化的SopB29-168蛋白； 对初步纯化的SopB29-168蛋白进行阴离子交换层析，具体步骤为：首先用50 mmol/L Tris-HCl、pH值为8.0的溶液平衡HiTrap Q HP阴离子交换柱，然后 将上述初步纯化的SopB29-168蛋白进行挂柱，挂柱结束后用5倍体积、pH值 为8.0的50mmol/L Tris-HCl缓冲液润洗两次，润洗结束后用pH值为8.0、 内含150mmol/L氯化钠的50mmol/L Tris-HCl缓冲液洗脱蛋白，最后将洗脱 下来的蛋白进行分子筛层析；所述分子筛层析的过程为：用20mmol/L pH值 为7.6的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液平衡Superdex20010/300层析柱，上样 后用20mmol/L pH值为7.6的羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES)缓冲液进行洗脱， 收集蛋白样品；将洗脱下来的蛋白样品采用SDS-PAGE电泳分离后，进行考马斯 亮兰染色鉴定，最后得到高纯度的目标蛋白为免疫原。

步骤3中，所述利用HiTrap NHS-activated HP亲和层析柱纯化抗血清具 体为:HiTrap NHS-activated HP亲和层析柱在使用前要进行预处理，即首先用 10-15倍体积的预冷的1mmol/L的盐酸溶液冲洗HiTrap NHS-activated HP亲 和层析柱，然后在得到的SopB29-168蛋白溶液中按照体积比为10:1的比例加 入pH值为8.3的内含2mol/L的碳酸氢钠和5mol/L氯化钠的溶液，从而得 到内含终浓度为0.2mol/L的碳酸氢钠和0.5mol/L氯化钠的SopB29-168蛋 白溶液；将所得含有碳酸氢钠和氯化钠的SopB29-168蛋白溶液按照体积比 0.5:1的比例加入到HiTrap NHS-activated HP亲和层析柱中，于4℃偶联过夜 后，用两倍体积的pH值为8.3的内含0.5mol/L的乙醇胺和0.5mol/L氯化 钠的溶液置换掉pH值为8.3的碳酸氢钠缓冲液；接下来依次用高pH值的溶液 和低pH值的溶液轮流润洗5次，所述高pH值的溶液为pH值为8.0的0.1mol/L  Tris-HCl溶液，所述低pH值的溶液为pH值为4.0的内含0.1mol/L醋酸钠和 0.5mol/L氯化钠的溶液；至此，SopB29-168蛋白与HiTrap NHS-activated HP 亲和层析柱的偶联完毕；将获得的抗血清中加入终浓度为10mmol/L、pH值为 7.5的Tris-HCl缓冲液，得到抗血清溶液；用获得的抗血清溶液挂偶联了SopB 29-168免疫原蛋白的HiTrap NHS-activated HP亲和层析柱；并用5倍体积的 10mmol/L、pH值为7.5内含0.5mol/L氯化钠的Tris-HCl溶液润洗，润洗完 毕后用pH值为2.5的0.1mol/L甘氨酸盐酸溶液进行洗脱，洗脱下来后迅速 按照体积比为10:1的比例往甘氨酸盐酸的洗脱液中加入浓度为500mmol/L的 pH值为7.6的Tris-HCl缓冲液，进而获得pH值接近中性的SopB多克隆抗体 溶液。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1.本发明的方法利用沙门氏菌效应蛋白SopB的N端第29-168位氨基酸间 的蛋白质作为抗原得到了沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体，有利于对沙门 氏菌效应蛋白SopB的免疫印迹分析、免疫组化分析以及双重免疫激光共聚焦的 显微观察，以及人们对肠道致病菌感染机制的深入研究。

2.本发明通过将编码沙门氏菌效应蛋白SopB29-168蛋白的基因序列克隆 至pSUMO表达载体，诱导、表达并纯化SUMO-SopB29-168融合蛋白，利用SUMO 蛋白酶Ulp1切去SUMO蛋白进而获得沙门氏菌效应蛋白SopB29-168。使用pSUMO 表达载体结合Ulp1蛋白酶来制备沙门氏菌效应蛋白SopB29-168免疫原蛋白有 两个显著优点：一方面SUMO蛋白酶Ulp1识别SUMO的空间结构，而不是一级 结构，避免了靶蛋白的非特异切割，而且经过切割的目标产物N-端不会携带多 余的氨基酸，得到的目标蛋白与天然的蛋白在氨基酸组成上完全一致。克服了 常规的蛋白表达载体在表达外源蛋白的过程中把包括标签蛋白在内的本不属于 作为免疫原的目标蛋白的一些氨基酸序列融合表达在目标蛋白上，避免了由于 非目标蛋白以外的多余氨基酸的存在而造成的抗体特异性不高的缺点，保证了 抗体的特异性。另一方面，在SUMO融合蛋白的N端含有6×His序列，而在pET28a 表达载体中表达的SUMO蛋白酶Ulp1的N端同样含有6×His序列，当Ulp1酶 切结束后可以一次性的用镍柱把SUMO标签蛋白以及Ulp1蛋白酶同时除去，而 作为免疫原的沙门氏菌效应蛋白SopB29-168蛋白则释放到酶切后的溶液中， 与SUMO蛋白以及Ulp1蛋白酶完全分开，进而保证了沙门氏菌效应蛋白SopB 29-168的纯度，同时减少了操作步骤，降低了纯化过程中沙门氏菌效应蛋白SopB 29-168的损失。

3、本发明的方法中，在第一裂解缓冲液中使用了细菌蛋白酶抑制剂混合物 cocktail3，这是一种专门用于抑制细菌蛋白水解酶的特异性抑制剂，减少了 细菌蛋白水解酶对SUMO-SopB29-168融合蛋白的水解，提高了蛋白纯化过程中 的回收率。

4、本发明的方法中，沙门氏菌效应蛋白SopB29-168蛋白进一步使用HiTrap  Q HP阴离子交换柱以及Superdex20010/300分子筛两种方法进行分离纯化， 制备了超过95%纯度的沙门氏菌效应蛋白SopB29-168蛋白作为免疫原，高纯度 的免疫原保证了抗体的特异性。

5.本发明的方法中，多克隆抗体的纯化采用的是HiTrap NHS-activated HP 亲和层析柱，将作为免疫原的沙门氏菌效应蛋白SopB29-168蛋白偶联至HiTrap  NHS-activated HP亲和层析柱后利用抗原与抗体之间的特异性结合纯化多克隆 抗体，有效避免了其余杂蛋白的非特异性结合，提高了制备的多克隆抗体的纯 度，为进一步的将多克隆抗体用于蛋白免疫印迹检测，免疫组化染色以及激光 共聚焦分析提供了高纯度的多克隆抗体。

6.本发明的方法制备的沙门氏菌效应蛋白SopB多克隆抗体具有灵敏度高 的特点，能够检测到低至10ng的沙门氏菌效应蛋白SopB。

7.本发明的方法制备的沙门氏菌效应蛋白SopB多克隆抗体具有特异性好 的特点，能够特异性的检测在大肠杆菌中表达的重组沙门氏菌效应蛋白SopB以 及沙门氏菌天然分泌的沙门氏菌效应蛋白SopB，可用于免疫组化、免疫印迹等 实验要求，建立体外免疫分析，为深入研究沙门氏菌感染过程中沙门氏菌效应 蛋白SopB的生物学功能提供了一个重要工具。

8.本发明制备的沙门氏菌效应蛋白SopB多克隆抗体还可用于环境以及食 品中污染的沙门氏菌的免疫检测。

9.本发明制备的沙门氏菌效应蛋白SopB多克隆抗体还可用于沙门氏菌免 疫荧光染色激光共聚焦显微观察。

附图说明

图1为作为免疫原的沙门氏菌效应蛋白SopB29-168蛋白的SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果图；图中：1泳道为蛋白标准，2、3泳道分别 为上样量为2μl和5μl的沙门氏菌效应蛋白SopB29-168蛋白电泳图；

图2为检测本发明制备的多克隆抗体对不同浓度的SopB29-168蛋白 的蛋白免疫印迹分析结果图；图中：1-4泳道依次分别为10ng,100ng,500ng, 1000ng作为免疫原的沙门氏菌效应蛋白SopB29-168蛋白；

图3为检测本发明制备的多克隆抗体对大肠杆菌中表达的GST-SopB融合蛋 白的特异性检测的蛋白免疫印迹分析结果图；图中：1泳道为未加IPTG诱导剂 诱导的对照组的大肠杆菌全细胞裂解液，2泳道为受0.1mmol/L IPTG诱导剂 诱导表达的GST-SopB融合蛋白的大肠杆菌全细胞裂解液；

图4为利用本发明制备的多克隆抗体检测沙门氏菌培养过程中沙门氏菌效 应蛋白SopB随着培养时间的延长其分泌量的变化的蛋白免疫印迹分析结果图； 图中：1-8泳道分别为培养0,2,4,6,8,10,12,14小时的沙门氏菌的上清液；

图5为利用本发明制备的多克隆抗体进行沙门氏菌的免疫荧光定位；

图6为利用抗LPS的抗体进行沙门氏菌的免疫荧光定位；

图7为图5和图6的重叠图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例

生物材料

鼠伤寒沙门氏菌LT2（Salmonella enterica subsp.enterica serovar  Typhimurium）保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）， 保藏单位地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，邮政编码为 100101，保藏日期为2012年12月20日，保藏编号为CGMCC No.7020。

pET28a表达载体购自Novagen公司；大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BL21(DE3) 菌株购自Promega公司；限制性内切酶NdeI、XhoI、BamHI、T4DNA连接酶、 Taq DNA聚合酶和细菌基因组DNA提取试剂盒均购自Takara公司；pSUMO表达 载体、pGEX-6P-2表达载体、HiTrap Q HP阴离子交换柱、Superdex20010/300 分子筛以及HiTrap NHS-activated HP亲和层析柱购自GE Healthcare；三羟甲 基氨基甲烷、丙烯酰胺、卡那霉素、氨苄、甲叉双丙烯酰胺、氯化钠、咪唑、 苯甲基磺酰氟、曲拉通X-100均购自AMRESCO公司；细菌蛋白酶抑制剂混合物 cocktail3（Protease Inhibitor Cocktail3Bacteria）购自德国AppliChem 公司；新西兰大白兔购自天津医科大学实验动物中心；弗氏完全佐剂和弗式不 完全佐剂均购自Sigma公司。抗LPS（脂多糖）抗体（编号为MA1-83451）购自 Thermo公司；羊血清白蛋白、Anti-rabbit IgG(H+L),F(ab')2Fragment(Alexa 488Conjugate)(编号为4412S)和Anti-mouse IgG(H+L),F(ab')2 Fragment(Alexa 555Conjugate)(编号为4409S)均购自Cell signaling 公司、胰蛋白胨、酵母提取物购自OXOID公司；DMEM培养基购自HyClone公司； 人肠上皮细胞Henle-407细胞（ATCC No.CCL-6）购自美国模式菌种收集中心 （American type culture collection,ATCC）；蛋白转印膜、Millicell EZ Slide 培养小皿均购自Millipore公司。

LB液体培养基的组成成分为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化 钠10g/L，用水定容至1L。

步骤一，免疫原序列的确立：

用BEPITOPE软件对沙门氏菌效应蛋白SopB的氨基酸序列，Genebank序列 号为NP_460064，如SEQ ID NO:1所示的序列，对该蛋白进行抗原决定簇的预测， 选出抗原决定簇峰值较高片段作为免疫原蛋白，即选出从N末端第29位至第168 位包括共计140个氨基酸，如SEQ ID NO:2所示的蛋白作为免疫原。

步骤二，pSUMO表达载体的构建:

SUMO蛋白，其氨基酸序列为Genebank序列号NP_010798，编码SUMO蛋白 的核苷酸序列，其Genebank序列号为NM_001180818。对于编码SUMO蛋白的核 苷酸序列(Genebank序列号NM_001180818)，去掉终止密码子TAG，根据如SEQ ID NO:3所示的序列，设计如SEQ ID NO:4所示的上游引物和SEQ ID NO:5所示的 下游引物。分别以此上下游引物对扩增SUMO基因片段，反应体系以及程序如下：

反应条件如下：

反应结束后，进行1.0％Agarose电泳鉴定并割胶回收目的条带。将回收 的SUMO条带与pET28a表达载体分别用NheI和BamHI双酶切，胶回收酶切产物。 然后构建10μl第二连接体系，该第二连接体系由1μl由NheI和BamHI双酶 切后的pET28a表达载体、7.5μlNheI和BamHI双酶切后的SUMO核酸片段、1 μl10×连接酶缓冲液和0.5μl T4DNA连接酶组成，连接条件是16℃连接过 夜。

将所得第二连接体系转化大肠杆菌DH5α，在含有34ug/ml卡那霉素的LB 平板上于37℃下培养12-16h，随机挑取4个单菌落接种于5ml含有34μg/ml 卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃下培养过夜，提取质粒并用Nhel和BamHI 双酶切鉴定，选取重组质粒测序，测序正确的即为所需pSUMO重组质粒。

步骤三，pET28a-Ulp1重组质粒的构建：

Ulp1(Ubl-specific protease,简称为Ulp1)最早是在酵母中发现的由621 个氨基酸残基组成的蛋白质。在结构上,Ulp1主要包括具有底物结合功能的N端 结构域(1-403氨基酸)和具有SUMO蛋白酶活性的C端结构域(404-621氨基酸)。 其中，404-621氨基酸间的C端结构域具有全长的Ulp1酶切活性,能够水解以α 氨基连接的SUMO-目的蛋白偶合物。

Ulp1蛋白酶，其氨基酸序列为Genebank序列号NP_015305，编码Ulp1蛋 白酶的核苷酸序列，其Genebank序列号为NM_001183834。根据编码Ulp1蛋白 酶C端第404-621位间氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的序列， 设计如SEQ ID NO:7所示的上游引物和SEQ ID NO:8所示的下游引物。

分别以此上游引物和下游引物扩增编码ULP1404-612蛋白的基因片段，反应体 系以及程序如下：

反应条件如下：

反应结束后，进行1.0％Agarose电泳鉴定并割胶回收目的条带。将回收 的Ulp1404-621基因片段与pET28a表达载体分别用BamHI和XhoI双酶切， 胶回收酶切产物。然后构建10μl第三连接体系，该第三连接体系由1μl由 BamHI和XhoI双酶切后的pET28a表达载体、7.5μlBamHI和XhoI双酶切后 的Ulp1404-621基因片段、1μl10×连接酶缓冲液和0.5μl T4DNA连接 酶组成，连接条件是16℃连接过夜。

将所得第三连接体系转化大肠杆菌DH5α，在含有34ug/ml卡那霉素的LB 平板上于37℃下培养12-16h，随机挑取4个单菌落接种于5ml含有34μg/ml 卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃下培养过夜，提取质粒并用BamHI和XhoI 双酶切鉴定，选取重组质粒测序，测序正确的即为所需的pET28a-Ulp1重组质 粒。

步骤四，pSUMO-SopB29-168重组质粒的构建

以沙门氏菌效应蛋白SopB全长氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的从N末端 第29位至第168位共计140个氨基酸如SEQ ID NO:2所示的蛋白质序列为免疫 原，根据如SEQ ID NO:9所示的编码沙门氏菌效应蛋白SopB N末端第29-168 位氨基酸序列的核苷酸序列设计如SEQ ID NO:10所示的上游引物和SEQ ID NO:11 所示的下游引物。

以在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏编号为CGMCC  No.7020的鼠伤寒沙门氏菌LT2的基因组DNA（GenBank Accession Number: NC003197）为模板，反应体系以及程序如下：

反应条件如下：

反应结束后，进行1.0％Agarose电泳鉴定并割胶回收目的条带。将回收 的SopB29-168核酸片段与步骤二中构建的pSUMO表达载体分别用BamHI和 XhoI双酶切，胶回收酶切产物。然后构建10μl第一连接体系，该第一连接 体系由1μl由BamHI和XhoI双酶切后的pSUMO表达载体、7.5μl BamHI 和XhoI双酶切后的SopB29-168核酸片段、1μl10×连接酶缓冲液和0.5 μl T4DNA连接酶组成，连接条件是16℃连接过夜。

将所得第一连接体系转化大肠杆菌DH5α，在含有34ug/ml卡那霉素的LB 平板上于37℃下培养12-16h，随机挑取4个单菌落接种于5ml含有34μg/ml 卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃下培养过夜，提取质粒并用BamHI和XhoI 双酶切鉴定，选取重组质粒测序，测序正确的即为所需pSUMO-SopB29-168重 组质粒。

步骤五，pSUMO-SopB29-168重组质粒的转化、培养、融合蛋白的诱导、裂 解和挂镍柱：

将步骤四选取的pSUMO-SopB29-168重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)， 过夜培养后挑取单克隆至5ml含有34μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在 37℃下培养过夜。将所得过夜培养物接种至1L含有34μg/ml卡那霉素的LB液 体培养基中，于37℃培养2.5-3h，至大肠杆菌BL21(DE3)的OD₆₀₀值为0.6-0.8 之间。在OD₆₀₀值为0.6-0.8的大肠杆菌BL21(DE3)培养液中加入IPTG至终浓度 为0.1mmol/L，22℃下振荡诱导培养12h。

将1L诱导后的大肠杆菌BL21(DE3)培养液离心收集菌体，用50ml第一裂解 缓冲液重悬，第一裂解缓冲的组成为：50mmol/L Tris-HCl,pH值为8.0,内 含500mmol/L氯化钠、20mmol/L咪唑、1mmol/L PMSF和0.2μmol/L细菌 蛋白酶抑制剂混合物cocktail3。将重悬后的菌液在0℃冰水浴中用超声波破 碎，400W功率间歇破碎90次，每超声3秒，间隔7s。将超声波破碎后的菌液 于13200转/分钟的转速下离心30min，收集上清液,将所得上清液用0.45μm 膜过滤后得到破碎的大肠杆菌上清液备用。

取2ml专门用于组氨酸（His）标签蛋白纯化的镍柱（Ni-NTA beads）， 轻微离心后，吸去上清液，镍柱用等体积的第一裂解缓冲液洗涤两次。将洗涤 后的镍柱加入用0.45μm膜过滤后的破碎的大肠杆菌上清液中，于4℃轻微 旋转混匀30min。用5倍体积的第一裂解缓冲液润洗三次后，得到挂有SUMO-SopB 29-168融合蛋白的镍柱。将挂有SUMO-SopB29-168融合蛋白的镍柱保存在1倍 体积的pH值为8.0的50mmol/L Tris-HCl缓冲液中，待用。

步骤六，SUMO蛋白酶Ulp1的诱导、表达与纯化：

将步骤三中构建的pET28a-Ulp1重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)，过夜 培养后挑取单克隆至5ml含有34μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，在37 ℃下培养过夜。将所得过夜培养物接种至1L含有34μg/ml卡那霉素的LB液体 培养基中，于37℃培养2.5-3h，至大肠杆菌BL21(DE3)的OD₆₀₀值为0.6-0.8 之间。在OD₆₀₀值为0.6-0.8的大肠杆菌BL21(DE3)培养液中加入IPTG至终浓度 为0.1mmol/L，22℃下振荡诱导培养12h。将1L诱导后的大肠杆菌BL21(DE3) 培养液离心收集菌体，用50ml第二裂解缓冲液重悬，所述第二裂解缓冲液的组 成为：50mmol/L Tris-HCl,pH值为8.0,内含500mmol/L氯化钠、20mmol/L 咪唑。将重悬后的菌液在0℃冰水浴中用超声波破碎，400W功率间歇破碎100 次，每超声3秒，间隔7s。将超声波破碎后的菌液于13200转/分钟的转速下离 心30min，收集上清液,用0.45μm膜过滤后得到Ulp1表达的大肠杆菌上清 液备用。

取2ml镍柱轻微离心后吸去上清液，镍柱用等体积的第二裂解缓冲液洗涤 两次。将洗涤后的镍柱加入用0.45μm膜过滤后的Ulp1表达的大肠杆菌上清 液中，于4℃轻微旋转混匀30min。用5倍体积的第二裂解缓冲液润洗三次后， 用50mmol/L Tris-HCl,pH值为8.0，内含200mmol/L咪唑的缓冲液洗脱Ulp1 蛋白酶。

步骤七，Ulp1酶切

将步骤六中制备的Ulp1蛋白酶溶液按照体积比1:10的比例加入到步骤五 中的挂满SUMO-SopB29-168融合蛋白的镍柱溶液中，置于4℃冰箱中酶切过夜， 第二天将酶切体系于4℃轻摇30min后于2000转/分离心2min，收集上清即 获得初步纯化的SopB29-168蛋白。

步骤八，SopB29-168蛋白的纯化：

为了得到高纯度的SopB29-168免疫原蛋白，对初步纯化的SopB29-168 蛋白进行阴离子交换层析。具体步骤为：首先用50mmol/L Tris-HCl,pH值为 8.0的溶液平衡HiTrap Q HP阴离子交换柱，然后将初步纯化的SopB29-168蛋 白进行挂柱，挂柱结束后用5倍体积的50mmol/L Tris-HCl,pH值为8.0的缓 冲液润洗两次，润洗结束后用50mmol/L Tris-HCl,pH值为8.0内含150mmol/L 氯化钠的缓冲液洗脱蛋白，最后将洗脱下来的蛋白进行分子筛层析。分子筛层 析的具体步骤为：用pH值为7.6的20mmol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES） 缓冲液平衡Superdex20010/300层析柱，上样后用pH值为7.6的20mmol/L HEPES缓冲液进行洗脱，收集蛋白样品。将收集的蛋白样品采用SDS-PAGE电泳 分离后，进行考马斯亮兰染色鉴定，结果如图1所示，沙门氏菌效应蛋白SopB N 端29-168蛋白的分子量约为17Kd，从2μl和5μl的上样量上可以看出，纯 化的沙门氏菌效应蛋白SopB29-168蛋白纯度超过95%，未见明显的杂带，可以 用来作为免疫原。

步骤九，抗血清的制备：

用步骤八纯化得到的SopB29-168免疫原免疫新西兰大白兔，首次免疫采 用弗氏完全佐剂进行皮下注射，注射剂量为1000μg/公斤./次。此后每隔14 天加强免疫一次，加强免疫采用的是弗氏不完全佐剂进行皮下注射，注射剂量 为300μg/公斤./次。共加强免疫3次。每次加强免疫7天后经静脉取血，分 离血清后进行双向琼脂扩散试验，当琼脂扩散效价达1：16者即为合格。达到 抗体效价检测合格后的免疫新西兰大白兔放血前一天晚上停食，可饮水。第二 天股动脉取血，制备抗血清。

步骤十，利用HiTrap NHS-activated HP亲和层析柱纯化抗血清得SopB多 克隆抗体：

SopB多克隆抗体的纯化使用的是HiTrap NHS-activated HP亲和层析柱， 该柱与其他抗体纯化方法相比具有纯化通量高、快速、目标抗体纯度高的优点。 HiTrap NHS-activated HP亲和层析柱在使用前要进行预处理，首先用10-15倍 体积的预冷的1mmol/L的盐酸溶液冲洗HiTrap NHS-activated HP亲和层析柱， 然后在步骤八中得到的SopB29-168蛋白溶液中按照体积比为10:1的比例加入 pH值为8.3的内含2mol/L的碳酸氢钠和5mol/L氯化钠的溶液，从而得到内 含终浓度为0.2mol/L的碳酸氢钠和0.5mol/L氯化钠的SopB29-168蛋白溶 液。将所得含有碳酸氢钠和氯化钠的SopB29-168蛋白溶液按照体积比0.5:1 的比例加入到HiTrap NHS-activated HP亲和层析柱中，于4℃偶联过夜后，用 两倍体积的pH值为8.3的内含0.5mol/L的乙醇胺和0.5mol/L氯化钠的置 换掉pH值为8.3的碳酸氢钠缓冲液。接下来依次用高pH值的溶液（0.1mol/L  Tris-HCl，pH值为8.0）和低pH值的溶液（0.1mol/L醋酸钠，0.5mol/L氯 化钠，pH值为4.0）轮流润洗5次。至此，SopB29-168与HiTrap NHS-activated  HP亲和层析柱的偶联完毕。

将步骤九中获得的抗血清中加入终浓度为10mmol/L，pH值为7.5的 Tris-HCl缓冲液，得到抗血清溶液。用获得的抗血清溶液挂步骤十中制备的偶 联了SopB29-168免疫原蛋白的HiTrap NHS-activated HP亲和层析柱。并用5 倍体积的10mmol/L，pH值为7.5内含0.5mol/L氯化钠的Tris-HCl溶液润洗， 润洗完毕后用pH值为2.5的0.1mol/L甘氨酸盐酸溶液进行洗脱，洗脱下来 后迅速按照体积比10:1的比例往甘氨酸盐酸的洗脱液中加入浓度为500mmol/L 的pH值为7.6的Tris-HCl缓冲液，进而获得pH值接近中性的SopB多克隆抗 体溶液。

实施效果

SopB多克隆抗体对免疫原识别的灵敏度检测：

将上述收集的SopB多克隆抗体溶液依次按照10ng,100ng,500ng,1000 ng的上样量进行蛋白免疫印迹分析，从图2中可以看到，通过上述方法制备的 沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体能够检测到低至10ng的SopB29-168免 疫原蛋白。

SopB多克隆抗体对大肠杆菌诱导表达的重组GST-SopB融合蛋白的特异性识 别：

以保藏标号为CGMCC No.7020的鼠伤寒沙门氏菌LT2基因组DNA为模板， 根据编码沙门氏菌效应蛋白SopB蛋白的全长氨基酸序列的核苷酸序列，如以SEQ  ID NO:12所示的序列，设计如SEQ ID NO:13所示的上游引物和SEQ ID NO:14所 示的下游引物作为引物对，利用Taq DNA Polymerase通过PCR扩增得到沙门氏 菌SopB全长核酸片段，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，56℃ 30s，72℃3min，共计30个循环；最后72℃延伸10min。将PCR产物与pGEX-6P-2 表达载体分别用BamHI和XhoI双酶切，胶回收酶切产物。构建第四连接体系具 体为10μl，该第四连接体系由1μl BamHI和XhoI酶切后的pGEX-6P-2表达 载体、7.5μl BamHI和XhoI酶切后的SopB全长核酸片段、1μl10×连接酶 缓冲溶液和0.5μl T4DNA连接酶组成。连接条件是16℃连接过夜。将该第四 连接体系转化至大肠杆菌DH5α中于37℃条件下在含有100μg/ml氨苄的LB固 体培养基中培养12h-16h。随机提取4个转化出来的单克隆并提取质粒，用 BamHI和XhoI进行双酶切鉴定，选取重组质粒测序，测序正确的即为所需重组 质粒pGEX-6P-2-SopB。

将pGEX-6P-2-SopB重组质粒转化至表达菌BL21(DE3)，过夜培养后挑取单 克隆接至5ml含有100μg/ml氨苄的LB液体培养基中，在37℃下培养过夜。 将所得过夜培养物按体积比1:100的比例进行扩大培养，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG于37℃诱导1h，收菌后将菌体 用5×SDS载样缓冲溶解并进行蛋白免疫印迹分析,结果如图3所示，与未加 IPTG诱导的1号泳道相比，用0.1mmol/L的IPTG诱导的2号泳道能够特异性 的检测到重组GST-SopB蛋白的表达，而不受其他蛋白的干扰。说明本发明的方 法所制备的SopB多克隆抗体能够特异性的检测到在大肠杆菌中诱导表达的重组 的GST-SopB蛋白。

鼠伤寒沙门氏菌LT2分泌SopB蛋白的时间进程分析：

将保藏编号为CGMCC No.7020的鼠伤寒沙门氏菌菌株LT2在LB固体平板上 进行划线过夜培养，挑取单克隆至5ml LB液体培养基中，每隔2小时取一次 培养液，每次取100μl，直至取至第14小时实验结束。将取得的100μl沙 门氏菌培养液于10000转/分钟的转速下离心10min，取上清，将上清中加入5 ×SDS载样缓冲，沸水浴变性5min后，利用本专利制备的沙门氏菌效应蛋白 SopB的多克隆抗体对沙门氏菌分泌的效应蛋白SopB进行蛋白免疫印迹分析。结 果如图4所示，从第6小时开始用SopB多克隆抗体开始能够检测到沙门氏菌分 泌的效应蛋白SopB，在6小时以后的时间内能够持续的检测到沙门氏菌效应蛋 白SopB的分泌。说明，利用本方法制备的沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗 体能够特异性的识别沙门氏菌分泌的天然的效应蛋白SopB。因此，利用本专利 制备的沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆抗体能够通过检测SopB蛋白的分泌而 特异性的用于环境以及食品中污染的沙门氏菌的免疫检测。

沙门氏菌感染贴壁培养的人肠上皮细胞后的免疫荧光染色激光共聚焦显微 观察:

将保藏编号为CGMCC No.7020的鼠伤寒沙门氏菌LT2菌株在LB固体平板上进 行划线过夜培养，挑取鼠伤寒沙门氏菌单克隆至5ml LB液体培养基中，37℃ 振荡培养12-16h。将菌在10000转/分钟的转速下离心10min，收集菌体，用DMEM 培养基将沙门氏菌重悬至菌液在600ng的吸光度值约为0.1-0.2之间。感染前一 天，首先将Henle-407细胞种在Millicell EZ Slide培养小皿中，培养基为内含 10%胎牛血清的DMEM培养基，于37℃下在5%二氧化碳浓度的二氧化碳培养箱中培 养至细胞的密度为80-90%之间，感染之前两小时，将密度为80-90%的Henle-407 细胞用100%DMEM培养基饥饿2h后弃去DMEM培养基，然后将用DMEM稀释的OD₆₀₀的吸光度值为0.1-0.2之间的沙门氏菌溶液加入到Millicell EZ Slide细胞培养 小皿中，感染半小时后，将沙门氏菌溶液吸走，用PBS缓冲液润洗两遍后，加入 内含100ug/ml庆大霉素的100%DMEM培养基继续培养1h，杀死细胞外没有进入 细胞的细菌。

然后将待染色观察的Henle-407细胞从二氧化碳培养箱中取出来，用4%的多 聚甲醛固定15min，然后用PBS缓冲液洗两遍，可以将皿倒扣在吸水纸上，稍微 用力的甩几下。用0.3%的曲拉通X-100处理细胞30min，然后再用PBS缓冲液洗 两遍。用PBS缓冲液配制2%的羊血清白蛋白，取约300μl加入Millicell EZ Slide 培养小皿中，盖住皿底部即可，封闭30至60min，然后再用PBS缓冲液洗两遍。

用PBS缓冲液配制2%的羊血清白蛋白作为封闭液，将封闭液按照体积比为 250：1的比例分别加入本发明步骤十中制备的SopB多克隆抗体和鼠源的抗鼠伤 寒沙门氏菌LPS的抗体，将该混合的一抗溶液加入用PBS缓冲液洗过的Millicell  EZ Slide培养小皿中，孵育过夜。从下面步骤开始，要求避光操作。第二天用 PBS缓冲液润洗三次Millicell EZ Slide培养小皿，将一抗洗去，再用2%的羊血 清白蛋白作为封闭液按照体积比为500：1的比例稀释二抗，二抗分别为 Anti-rabbit IgG(H+L),F(ab')2Fragment(Alexa Conjugate)和 Anti-mouse IgG(H+L),F(ab')2Fragment(Alexa Conjugate),将 混合的二抗溶液加入到用一抗处理过的Millicell EZ Slide培养小皿，孵育1h 后用PBS润洗两遍。最后，将Millicell EZ Slide培养小皿封片后用TCS-SP2激 光共聚焦显微镜（Leica,Japan)进行显微观察并拍照，结果如图5-图7所示， 图5为利用本专利制备的多克隆抗体作为一抗检测到的入侵宿主细胞内的沙门 氏菌，图6为利用鼠源的抗鼠伤寒沙门氏菌LPS抗体作为一抗检测到的宿主细胞 内的沙门氏菌，图7为图5和图6重叠后的图像。从图中可以看出，虽然用本发明 制备的多克隆抗体进行沙门氏菌的免疫荧光定位稍微有一点背景颜色，但是并 不影响沙门氏菌的观察。而且其最显著的荧光部分与利用抗LPS抗体作为一抗的 荧光部分完全吻合，充分表明，本专利制备的沙门氏菌效应蛋白SopB的多克隆 抗体能够专一性的用于沙门氏菌的免疫荧光定位分析。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。