无毒性产气荚膜梭菌ε毒素突变体的表达及免疫保护力评价

摘要

[目的]获得产气荚膜梭菌ε毒素(ETX)的无毒重组突变体,并评价其毒力及免疫原性.[方法]对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因按照大肠杆菌偏爱密码子进行优化设计.同时,将第1 06位的组氨酸和第1 99位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸和谷氨酸,经人工合成,获得基因片段GETXm2.将GETXm2克隆至原核表达载体pET30a-(+)后,将pET30a-GETXm2转化至BL21(DE3)感受态细胞中,在1 5℃和37℃两种条件下分别用IPTG诱导16 h和4h,超声破碎后收集上清和沉淀,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测重组蛋白的表达情况及其可溶性.利用Ni-IDA亲和层析方法对可溶性表达的重组蛋白进行纯化,从而获得重组蛋白rETXm2.利用Western blot方法,检测rETXm2与D型产气荚膜梭菌ETX抗血清的反应性.将rETXm2用细胞维持液稀释至1 00及10 μg·mL-1,检测其对犬肾细胞系(MDCK细胞)的毒力.分别用胰酶活化前和活化后的rETXm2,以0.0625、0.625和6.25 mg·kg-1 3个剂量尾静脉注射,检测rETXm2对小鼠的毒力.随后,将rETXm2与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,取4只健康家兔,皮下免疫2次(间隔两周),100 μg/只.同时,Montanide ISA 201佐剂与PBS混合液免疫组作为对照组.分别在一免后14 d以及二免后21 d,采血,分离血清,按照《中华人民共和国兽药典》(2 01 5年版)规定的方法检测血清对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价.同时,在二免后21 d,对家兔经耳缘静脉注射1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素,检测rETXm2对家兔的免疫保护效果.[结果]在1 5℃和37℃条件,rETXm2在BL21(DE3)菌体中均以可溶性和包涵体两种形式表达,综合考虑重组蛋白的表达量、可溶性及诱导时间,选择纯化在37℃条件下诱导获得的可溶性rETXm2.灰度扫描结果显示,在37℃诱导条件下,rETXm2可溶表达比例达30％;Western blot检测结果表明,D型产气荚膜梭菌毒素抗血清能够特异性的识别rETXm2,出现特异性反应条带.MDCK细胞毒性实验显示,在rETXm2浓度为100 μg·mL-1的细胞培养基中孵育24h后,细胞未出现细胞病变,而2 000倍稀释的D型产气荚膜梭菌天然毒素细胞培养基孵育组的细胞出现了明显的细胞病变;小鼠安全试验显示,尾静脉注射6.25 mg·kg-1剂量的rETXm2,对小鼠无致死性;血清中和试验结果显示,rETXm2免疫组每毫升的一免兔抗血清可中和450-750个小鼠MLD,每毫升的二免兔抗血清可中和2 500-4 000个小鼠MLD的D型产气荚膜梭菌毒素,而对照组的兔抗血清对D型产气英膜梭菌毒素无中和作用;用1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔4/4保护.[结论]产气荚膜梭菌rETXm2毒力基本丧失,但保留了良好的免疫原性,是D型产气荚膜梭菌病基因工程亚单位疫苗的理想候选抗原蛋白.