产气荚膜梭菌α毒素基因在干酪乳杆菌基因组中的表达及免疫效果评价

摘要

产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是引起动物坏死性肠炎、肠毒血症以及创伤性坏疽的主要病原菌之一。它的主要致病因子是其所产生的外毒素，目前发现的外毒素共有12种，其中α毒素是最重要的一种。外毒素通过肠道黏膜吸收或感染引起人和动物发病。因此，以增强黏膜免疫为主的免疫方式是预防该病的有效措施。 乳酸菌作为人和动物肠道、呼吸道和泌尿生殖道中的常在益生菌群之一，在食品和发酵中的长期应用早已证明其安全级特性。乳酸菌能非特异性提高人和动物的免疫力，特别是在提高人和动物的胃肠道粘膜免疫功能方面[1]。乳酸菌也可作为外源抗原表达的传递系统，并能诱导特异性的局部黏膜和系统免疫应答，这为利用乳酸菌的益生功能和特异性的疾病预防奠定了重要的理论和实践基础。目前对于乳酸菌作为抗原传递系统表达外源抗原的研究主要集中在质粒表达的研究上。质粒表达系统存在筛选的抗生素抗性基因，以此作为疫苗可能会使动物产生抗生素耐药性问题，不符合生物安全标准。而且，质粒表达系统存在不稳定性，质粒容易丢失等缺陷。 本研究以干酪乳杆菌为传递载体，以开发食品级安全的产气荚膜梭菌α毒素疫苗为目标，构建了一个温度敏感型自杀型质粒系统pGBHCupp-2A2B-PPαT，该质粒包含HCE组成型强启动子、PgsA锚定序列、产气荚膜梭菌α毒素抗原和大肠杆菌rrnB T1T2强终止子(PPαT)。将该质粒电转化到干酪乳杆菌L.casei中，经过两次升温处理和5-FU抗性筛选，获得一株基因组整合菌株PPαT△upp L.casei，对该整合菌株形态学特性、遗传稳定性和生长特性分析，结果表明:和野生型L.casei相比，形态学特性并未发生改变，但生长速度非常缓慢。对该重组菌转接50次之后，PPαT表达盒PCR检测仍然是稳定的，且测序结果的同源性仍为100％。 为了验证PPαT表达盒在整合菌株中是否能够表达，表达产物是否能够锚定在菌体细胞表面，我们采用了western blotting、间接酶联免疫吸附实验(ELISA)和激光共聚焦技术对其进行逐一验证。western blotting结果显示整合菌株在74kDa左右均出现一条PgsA-toxin融合表达的蛋白条带，而野生型L.casei对照组则未出现这一条带。说明PgsA-toxin融合蛋白被表达。ELISA结果显示三株重组菌蛋白OD490吸光值分别为0.6962±0.1145、0.4935±0.0239、0.5455±0.0318，而阴性对照组为0.2468±0.0282。组间差异显著(p≤0.01)。结果同样显示α毒素蛋白被表达，而且具有生物学活性。激光共聚焦结果显示整合菌株细胞表面出现大量绿色荧光，而对照组则未出现可见绿色荧光，说明表达蛋白被锚定在菌体细胞表面。以上结果表明我们成功得到了一株具有无任何选择性标记的、携带有PPαT表达盒元件的基因组整合的重组干酪乳酸杆菌，且整合的外源基因能够随着细菌的复制而进行表达，因此，可以将该基因组整合菌株作为食品级疫苗的候选菌株。 将6-8周龄BALB/e小鼠，免疫后的小鼠在不同时间取样，结果显示在免疫后的第7天，就可以检测到特异性IgA和IgG抗体。组间差异显著。免疫后第56天无菌采集小鼠脾脏，进行脾淋巴细胞增殖实验，结果表明:不同浓度抗原刺激，实验组均比对照组脾淋巴细胞增殖效果明显，但同一免疫组相比，低剂量的抗原刺激效果优于高剂量组。分离的脾细胞用流式细胞仪检测胞内的细胞因子水平，结果显示:免疫PPαT△upp L.casei组白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-γ(IFN-γ)与对照组相比都有所升高，但相比之下IL-2升高更为明显。IL-4和IL-10与对照组相比也明显升高，但相比之下IL-4升高更为明显。此实验结果说明免疫PPαT△upp L.casei组的抗原既能刺激机体产生细胞免疫也能刺激机体产生体液免疫。 小鼠经4次免疫后，腹腔注射不同最小致死剂量(minimum lethal dose，MLD)的α毒素进行攻毒保护试验，结果显示PPαT△upp L.casei组能完全抵抗1.5MLDα毒素的攻击，2MLD攻击时，保护率为1/3。其余三组阴性对照采用1 MLD攻击后均在24小时内全部死亡，表明重组菌免疫小鼠能够产生免疫保护作用。 分别取4次免疫后的PPαT△upp L.casei小鼠血清、△uppL.casei血清、L.casei血清和未免疫血清与等量的1.5个MLDα毒素混合，37℃作用1小时后，每组腹腔注射小鼠4只。结果表明，PPαT△upp L.casei小鼠血清组的4只小鼠均健康存活，而其余三组血清在24小时均全部死亡。 本实验首次以干酪乳杆菌为目的菌株进行基因整合和基因组表达，重组菌免疫小鼠既能刺激机体产生体液免疫也能刺激机体产生细胞免疫，为产气荚膜梭菌疫苗的进一步研制提供了实验数据，也为其它微生物研制食品级安全疫苗提供了新的思路。

目录

声明

摘要

1 引言

1．1 目的和意义

1．2 产气荚膜梭菌免疫防治相关研究进展

1．2．1 产气荚膜梭菌概况

1．2．2 产气荚膜梭菌α毒素的研究进展

1．2．3 α毒素疫苗的研究进展

1．3 乳酸茵作为疫苗载体的研究进展

1．3．1 乳酸菌作为疫苗传递系统的优势

1．3．2 乳酸菌与粘膜免疫系统

1．4 乳酸菌基因打靶操作系统研究进展

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 载体质粒与菌株

2．1．2 主要化学试剂

2．1．3 主要仪器设备

2．2 试验方法

2．2．1 HCE启动子的克隆与活性验证

2．2．2 表达盒(PPαT)的构建

2．2．3 表达盒PPαT表达的验证

2．2．4 pGBHCupp-2A2B-PPαT重组质粒的构建

2．2．5 乳酸菌感受态细胞的制备及转化

2．2．6 含PPαT表达盒转基因干酪乳杆菌的筛选

2．2．7 重组干酪乳杆菌PPαTΔupp L．casei ATCC 393特性分析

2．2．8 PPαTΔupp L．casei ATCC 393表达

2．2．9 口服PPαTΔupp L．casei ATCC免疫学指标的测定

2．2．10 免疫鼠攻产气荚膜梭菌α毒素保护性试验

3 结果与分析

3．1 启动子HCE的克隆与鉴定结果

3．1．1 启动子HCE PCR扩增结果

3．1．2 启动子HCE酶切与PCR鉴定结果

3．2 启动子HCE表达验证

3．2．1 pHCEG2-SLS质粒鉴定结果

3．2．2 pHCE612-SLS在干酪乳杆菌中的表达

3．3 α毒素基因的克隆与鉴定结果

3．4 PPαT表达盒的构建结果

3．5 表达盒在pPG612载体中的表达验证

3．6 pGBHCupp-2A2B-PPαT重组质粒的获得

3．6．1 pGBHCupp-2A2B-PPαT/TG1质粒酶切鉴定结果

3．6．2 pGBHCupp-2A2B-PPαT/L．casei质粒鉴定结果

3．6．3 pGBHCupp-2A2B-PPαT重组质粒构建策略

3．7 pGBHCupp-2A2B-PPαT质粒与L．casei重组鉴定结果

3．7．1 PCR鉴定结果

3．7．2 基因组PCR测序结果

3．8 PPαTΔupp L．casei重组菌特性研究

3．8．1 PPαTΔupp L．casei形态学特性分析

3．8．2 PPαTΔupp L．casei遗传稳定性分析

3．8．3 PPαTΔupp L．casei生长特性分析

3．8．4 5-FU抗性研究

3．9 PPαTΔupp L．casei基因组表达结果

3．9．1 Western blotting结果

3．9．2 间接ELISA结果

3．9．3 激光共聚焦结果

3．10 口服PPαTΔupp L．casei ATCC免疫学指标的测定

3．10．1 免疫小鼠特异性抗体IgA测定

3．10．2 免疫小鼠血清中特异性抗体IgG测定

3．10．3 脾淋巴细胞增殖实验

3．10．4 CD4细胞亚类及细胞因子的检测

3．11 免疫小鼠攻毒保护性试验结果

3．11．1 天然α毒素致病性试验结果

3．11．2 最小致死量(MLD)测定结果

3．11．3 攻毒试验结果

3．11．4 免疫小鼠血清对产气荚膜梭菌α毒素的中和效力试验结果

4 讨论

4．1 重组产气荚膜梭菌α毒素的去毒性

4．2 构建的表达盒元件

4．3 温敏型质粒和L．casei ATCC 393的同源重组

4．4 重组菌的表达情况

4．5 口服重组干酪乳杆菌粘膜免疫效果分析

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间发表的学术论文