O型口蹄疫病毒核酸检测标准样品的制备

摘要

利用基因克隆和体外转录技术制备O型口蹄疫病毒(FMDV)核酸检测标准样品.设计O型FMDV 3D基因的全长开放阅读框的克隆引物,RT-PCR获得相应片段,连接至PGEM-T载体,测序后采用体外转录方法制备RNA纯品,初步定量稀释后,混合分装作为核酸标准样品候选物.采用实时荧光定量RT-PCR方法进行均匀性和稳定性检验,并委托外部实验室采用外标实时定量RT-PCR方法对转录的RNA片段进行定值.通过绘制荧光定量标准扩增曲线计算标准物质含量(拷贝数),并根据委托单位的定值结果进行不确定度的估算.均一性结果显示瓶间差异小于5％,稳定试验表明室温20℃～25℃(相对湿度20％～50％)14 d,2℃～8℃3个月及-20℃保存1年的含量均无明显变化.核酸标准物质定值为(1.260士0.485)×108 copies,可用作O型FMDV通用核酸检测的标准质控品.