O型口蹄疫病毒VP1蛋白表达及单克隆抗体的制备

摘要

口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)引起的一种烈性动物传染病，严重危害畜牧业健康发展和公共卫生安全，我国将其列为一类动物疫病。目前控制该病的主要方法是抗体检测和疫苗免疫相结合。FMDV有7个血清型，不同血清型的FMDV之间无交叉保护性，引起我国牲畜发病的血清型主要有 O、A、AsiaⅠ三个血清型，其中 O型流行最为广泛。VP1蛋白作为O型FMDV的主要结构蛋白，包含其中大部分刺激机体产生中和抗体的中和性抗原位点，分别位于羧基端200-213位氨基酸残基的线性表位上、B-C环上和G-H环内，因此VP1抗体作为FMDV免疫产生的主要中和抗体，是评估疫苗免疫效果的重要依据。本试验将转化了 VP1融合蛋白基因的JM109在 IPTG的诱导下进行表达并进行表达条件的优化；以 VP1融合蛋白（rVP1蛋白）为包被抗原建立了间接 ELISA抗体检测方法，以 PEG2000为融合剂将免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，有限稀释法筛选阳性克隆，制备单克隆抗体并进行鉴定。试验结果如下：
　　1、O型FMDV VP1基因的克隆与原核表达
　　参考 GeneBank上发表的O型 FMDV VP1基因序列，设计两条特异性引物，通过 PCR扩增，将其克隆至表达载体 pQE-30上，转化至大肠杆菌 JM109中，经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE鉴定，结果显示：VP1基因扩增产物条带大小约为560 bp，与预期扩增片段大小一致；表达的O型rVP1蛋白大小约为26 kDa，纯化效果较好，未见其他杂带，蛋白浓度达2.85 mg/mL，说明 O型rVP1蛋白得到了高效地表达；Western-blot鉴定结果说明表达的O型rVP1蛋白具有很好的反应原性。O型rVP1蛋白的成功表达为建立 O型FMDV VP1抗体血清学检测方法打下了基础。
　　2、间接ELISA检测抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗体方法的建立
　　采用方阵滴定法对抗原包被浓度、包被条件、血清稀释浓度、酶标二抗稀释浓度、最适封闭剂进行筛选，进行特异性实验。结果显示:最佳包被抗原浓度为2.0μg/mL，最佳包被温度和时间为4℃过夜，血清最适稀释倍数为 l∶200，酶标二抗最适稀释倍数为l∶3000，最适封闭液为1％BSA-PBST溶液。该方法与A型FMDV、AsiaⅠ型FMDV、SVDV阳性血清不发生反应，仅与O型FMDV阳性血清反应，表明其特异性良好。本研究建立的间接 ELISA为我国O型FMDV VP1抗体检测提供了一种简便快捷的检测方法。
　　3、抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的鉴定及鉴定
　　本研究以高浓缩的O型FMDV灭活疫苗免疫 BALB/c小鼠，取阳性免疫鼠脾细胞与 SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，采用间接 ELISA方法鉴定，经4次亚克隆后，筛选能稳定分泌抗O型FMDV VP1蛋白MAbs的杂交瘤细胞株。将杂交瘤细胞株注入小鼠腹腔制备腹水，选取腹水效价高的杂交瘤细胞株进行单抗亚型鉴定及纯化；测定杂交瘤细胞的染色体数目、相对亲和力常数、特异性、稳定性等生物学特性；采用阻断ELISA试验检测单抗与O型FMDV反应的特异性。结果：筛选出了1株可稳定分泌抗 O型 FMDV VP1蛋白抗体的杂交瘤细胞株（1C7），1C7的染色体数高于任一亲本细胞的染色体数目；腹水的抗体效价为1:105，浓度为4.7 mg/mL。1C7分泌的MAbs亚型鉴定为IgG2b；相对亲和力常数为1.5 mol/L；间接 ELISA试验结果表明其可以特异性地与 O型 FMDV反应，而与 A型、AsiaⅠ型 FMDV及猪水泡病病毒均不发生交叉反应；Western-blot试验结果表明MAbs可特异性与原核表达的O型重组VP1蛋白（O-rVP1）反应；杂交瘤细胞传代至30代、在液氮中冻存12月后复苏，其分泌抗体稳定；阻断 ELISA试验表明1C7单抗能够被 O型 FMDV免疫血清特异性地阻断。本研究为进一步建立基于单抗检测O型FMDV抗体和病原的阻断ELISA及胶体金免疫层析快速检测方法奠定了基础。

目录

声明

符号表

第1章 文献综述

1.1 口蹄疫

1.2 口蹄疫诊断方法

1.3 单克隆抗体在口蹄疫诊断中的应用

1.4 本研究的目的和意义

第2章 O型口蹄病毒VP1基因的克隆与原核表达

2.1 材料

2.2 方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

第3章 间接ELISA检测抗O型口蹄疫病毒VP1蛋白抗体方法的建立

3.1 材料

3.2 方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

第4章 抗O型口蹄病毒VP1蛋白单克隆抗体制备

4.1 材料

4.2 方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

第5章 结论

参考文献

致谢

硕士期间的研究成果