O型口蹄疫病毒VP1蛋白原核表达及结构预测

摘要

口蹄疫(foot and mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(foot and mouthdisease virus，FMDV)引起的偶蹄动物发生的急性、热性、高度接触性传染病。当前对口蹄疫的预防工作极为重视，但是口蹄疫病毒的易变异性，经常使免疫毒株与流行毒株之间存在差异，而各个毒株之间在毒力、流行情况、抗原性之间均存在一定差异。本实验将0型口蹄疫病毒VP1基因与PET-28a和PET-41a两个原核表达载体进行连接，通过时间、温度、IPTG的浓度来优化表达条件，并应用乙醇和二硫苏糖醇试图促进VP1蛋白的可溶性表达，但效果均不显著。至从1989年口蹄疫病毒粒子晶体结构的建立，揭示了口蹄疫病毒生物学功能的物质基础，不仅有益于口蹄疫病毒的防治而且有利于从蛋白质的组成和构象角度展示酶的催化功能、蛋白存在形式(如包涵体的形成)、结合能力、物质之间相互识别，使我们深入、全面的了解蛋白质的结构、功能以及多态性。本实验通过运用多种软件和SWISS-MODEL服务平台，预测了0型口蹄疫病毒VP1蛋白的多种二级结构并与PDB数据库中的1fod1进行了比较，发现VP1蛋白增加了一个螺旋5-7残基处，减少了四个B转角位置在4-7、5-8、102-105、135-138残基处，其它二级结构并没有改变，说明VP1蛋白中的氨基酸改变既能够改变一些二级结构从而形成新的螺旋或折叠，同时有些氨基酸的改变又不影响原先存在的二级结构，这为生物进化过程中保守与多样性提供了新的视角。 运用SWISS-MODEL服务平台我们预测了0型口蹄疫病毒VP1蛋白的三维空间结构，并对三维空间结构进行了评估。通过蛋白质三维结构相似性比较发现氨基酸的改变导致一定空间结构改变，为抗原位点的筛选、毒力差异、流行情况、蛋白之间的相互作用提供了物理基础。

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论文说明：图表目录、英文缩略表

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前言

第一章 口蹄疫研究进展

1.1口蹄疫病毒生物学特征

1.2 口蹄疫病毒基因组结构和功能

1.3 口蹄疫病毒VP1基因的重要性

1.4诊断

1.4.1凝集试验

1.4.2琼脂扩散试验

1.4.3酶联免疫吸附试验(ELISA)

1.4.4透明带TM色谱测试技术

1.4.5免疫电压生物传感器

1.5分子生物学诊断技术

1.5.1核酸探针法

1.5.2核酸指纹图法(T1酶谱法)

1.5.3核酸序列分析法

1.5.4多肽分析法

1.5.5 RT-PCR

1.6防治

1.6.1传统疫苗

1.6.2新型疫苗

1.6.3 RNA干扰

1.7蛋白质结构测定方法

1.7.1 X射线晶体衍射法

1.7.2核磁共振技术

1.7.3冷冻电镜三维重构技术

1.7.4圆二色性光谱法

1.8蛋白质三维结构理论预测方法

1.8.1同源模建

1.8.2折叠识别法

1.8.3从头预测法

1.9展望

第二章 原核表达载体的构建及表达

2.1材料

2.1.1菌种与质粒

2.1.2生物试剂

2.1.3主要仪器

2.2方法

2.2.1 VP1基因的PCR扩增

2.2.2 VP1基因的T载体克隆

2.2.3重组表达载体的构建

2.2.4 VP1序列测定

2.2.5 PET-28a-VP1表达条件的优化

2.2.6 PET-41a-VP1表达条件的优化

2.2.7重组PET-28a-VP1蛋白的变性Ni柱纯化

2.2.8 Western-blot分析

2.3结果

2.3.1 VP1基因的PCR扩增结果

2.3.2 VP1基因原核表达载体的构建

2.3.3 PET-28a-VP1诱导表达与可溶性分析

2.3.4 pET-41-VP1的诱导表达

2.3.5镍离子亲和层析纯化

2.3.6 VP1蛋白的western-blot

2.4讨论

第三章 口蹄疫病毒VP1蛋白结构预测及分析

3.1材料与方法

3.1.1 VP1氨基酸序列

3.1.2结构预测与分析

3.2结果

3.2.1 VP1蛋白一级结构分析

3.2.2 VP1蛋白二级结构分析

3.2.3蛋白质二级结构的不规则评估

3.2.4蛋白质结构模型评估

3.2.5 VP1蛋白柔性、抗原性及表面可及性分析

3.3 VP1蛋白三级空间结构

3.3.1 VP1蛋白三维模型

3.3.2不同旋转角度的VP1蛋白三维模型

3.3.3 VP1蛋白空间结构预测结果评估

3.4讨论

第四章 结论

参考文献

附录

致谢

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