整合siRNA技术的结核核酸疫苗的AAV载体构建与浓缩纯化

摘要

引进腺病毒相关病毒载体系统(AAV载体系统),并通过PCR、酶切、连接等分子克隆手段将之前对于结核研究的成果转移至该系统中,完成同时具备小干扰RNA( si-Mcl-1)和结核融合抗原(AG85B-ESAT6)表达单位的二重表达载体的构建.转染AAV-293细胞,包装重组AAV病毒颗粒(rAAV)并收集病毒.分别设计另外两组rAAV表达载体:rAAV-EGFP与rAAV-siEGFP-EGFP.两组表达载体转染AAV-293包装病毒并感染HT1080细胞.荧光显微镜检测,感染后HT1080细胞48h后表达荧光蛋白,证明病毒包装成功.通过流式细胞仪检测,前者荧光表达占总细胞2.78%,后者荧光表达占总细胞0.75%.证明rAAV表达载体中siRNA表达部分正常发挥其抑制作用.为进一步提高感染效率,利用超滤浓缩方法浓缩纯化rAAV载体.感染HT1080,48 h至72 h通过流式细胞仪检测,前者荧光表达细胞占细胞总数10.18%,后者荧光表达细胞占细胞总数1.55%.