结核分支杆菌Ag85B融合蛋白表达载体的构建及纯化

摘要

目的:构建结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌的融合表达载体,制备MBP/Ag85B融合蛋白并将其纯化。方法:常规方法构建重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B,内切酶EcoRⅠ/HindⅢ酶切鉴定;重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B转化大肠杆菌,经0.3mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-Dthiogalactoside熏IPTG)诱导表达产生融合蛋白(MBP/Ag85B),Westernblot鉴定表达产物。pMAL纯化树脂(Amyloseresin)对MBP/Ag85B融合蛋白纯化。结果:重组质粒pMAL-p2-Ag85B经EcoRⅠ/HindⅢ酶切后,1%琼脂糖凝胶电泳证实Ag85B正向插入pMAL-p2载体,重组菌经IPTG诱导后,有约70kD蛋白表达,与预期的融合蛋白分子量相符,蛋白表达量约占细菌总蛋白量的40%;Westernblot显示,MBP/Ag85B融合蛋白与人抗结核IgG抗体呈特异性反应;经Amyloseresin纯化后,MBP/Ag85B融合蛋白的纯度可达95%以上。结论:成功构建结核分支杆菌Ag85B重组融合蛋白表达质粒并制备及纯化其融合蛋白,为进一步研究Ag85B生物学功能及其抗原表位分析奠定了物质基础。