结核分支杆菌HSP70原核表达载体的构建和表达及蛋白纯化

摘要

目的:构建结核分支杆菌HSP70原核表达载体并诱导其表达和纯化及鉴定目的蛋白.方法:利用PCR技术从牛型结核分支杆菌基因组中扩增出Mtb HSP70 DNA序列,构建重组质粒pGEM-Mtb HSP70,经酶切、PCR和测序鉴定后,将Mtb HSP70基因亚克隆到原核表达质粒PQE30,构建重组表达质粒PQE30-Mtb HSP70,在大肠杆菌M15中诱导表达.用镍凝胶亲和层析的方法纯化目的蛋白,Western blotting杂交鉴定纯化蛋白.结果:经测序证实,获得的目的基因与GenBank中公布的结核杆菌Mtb HSP70基因序列一致.构建的原核表达载体PQE30-Mtb HSP70在大肠杆菌M15中经1 mmol·L-1 IPTG诱导后表达出相对分子质量约为70 400的蛋白,镍柱纯化后经抗组氨酸单克隆抗体进行Western blotting,在相对分子质量约70 400处可见特异性着色带.结论:成功构建原核表达载体PQE30-Mtb HSP70,并成功诱导Mtb HSP70蛋白的表达,通过镍凝胶亲和层析法获得纯度较高的Mtb HSP70蛋白.