一种表达miRNA的AAV辅助包装载体及该载体的构建方法、筛选方法和应用

摘要

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种表达miRNA的AAV辅助包装载体及该载体的构建方法、筛选方法和应用；所述载体基于Rep2与CapDJ辅助包装载体，在CMV启动子驱动下的miR33‑5’UTR和miR33‑3’UTR之间插入克隆miRNA的位点2×BsmBI，miRNA表达小片段连接入所述骨架载体的2xBsmBI位点。所述载体的构建方法包括：制备克隆用骨架；制备miRNA表达小片段；将miRNA表达小片段连接至克隆用骨架载体上。所述筛选方法包括：用所述载体转化Stbl3感受态细菌，质粒提取；将提取的质粒共转染293T细胞；滴度比较筛选。本发明实现提高AAV生产效率约50％以上。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种表达miRNA的AAV辅助包装载体及该载体的构建方法、筛选方法和应用。

背景技术

目前基因治疗从近几十年来无数科学家的梦想正逐步变成了现实。基因治疗的载体一直是整个基因治疗的关键：需要能满足安全性、有效性、特异性。多种病毒、非病毒载体经过多年的演变、淘汰，目前重组腺相关病毒(rAAV)载体是公认为符合以上三个标准的基因治疗载体。由于AAV的生产得率长期以来提升缓慢，因而临床应用的普及程度也受此制约。随着近几年来第一个被欧盟批准的治疗脂肪酸酶缺陷的基因治疗药物Glybera上市，Spark Theraputics公司的治疗先天性失明的SPK-RPE65三期临床表现优秀，AAV作为基因治疗载体的方向与道路已完全被证明，但AAV的生产效率仍是基因治疗的关键瓶颈。一个需要全身性转导的遗传疾病需要AAV约1x 10¹⁵AAV基因组拷贝数(GC)的颗粒，而这个临床级别的生产量需要50万美元。生产上，如果用目前实验室能力范围内一次50个15cm盘可获得得1x10^13GC的生产效率来计算，则需要要生产100次或100倍的生产规模才能得到治疗一个病人的总量。

因此，AAV的产量瓶颈亟待打破。目前AAV的主流生产方法是三质粒转染293T细胞方法。三质粒转染法简单、快速，但由于293T为贴壁细胞，这种方法在规模上的扩展较有困难。但如果能把贴壁细胞驯化为悬浮细胞，则该方法会打破自身的局限，成为规模化工业生产的重要候选方案。把贴壁的293T细胞驯化为悬浮细胞近几年已有人取得成功，但由于原本的生产效率仍是未能满足需求，因此规模化生产只能靠单一地增加生产规模。因此，在方法上改进、创新，取得更高的AAV产率是目前基因治疗的热点之一。

发明内容

有鉴于此，有必要针对的问题，提供一种表达miRNA的载体及该载体的构建方法、筛选方法和应用，所述载体用作miRNA的表达，以提高AAV生产；所述构建方法、筛选平台实现高通量处理各环节，省去各个载体单独克隆及测序验证的步骤，从而在得到有效筛选结果的基础上节省大量资源与人力。

本发明通过以下技术方案实现：

一种基于常规的Rep2与CapDJ辅助包装载体的表达miRNA的载体，结构如图1所示，在Rep2与CapDJ辅助包装载体中CMV启动子驱动下的miR33-5’UTR(SEQ ID NO:1)和miR33-3’UTR(SEQ ID NO:2)之间插入克隆miRNA的位点2x BsmBI，将miRNA表达小片段连接入骨架载体的2xBsmBI位点，并以合成的pA终止子终止转录。

进一步的，所述表达miRNA的载体的构建方法，步骤包括：

(1)、制备线性化粘性末端的克隆用骨架；

(2)、制备双链带粘末端的miRNA表达小片段；

(3)、将(2)中miRNA表达小片段连接至(1)中克隆用骨架上。

进一步的，所述表达miRNA的载体的构建方法，具体步骤包括：

(1)、用上述含有CMV-miR33-5’UTR-2xBsmBI-3’UTR表达盒的Rep/CapDJ辅助包装载体作为miRNA表达克隆骨架载体，命名为mRRC，BsmBI酶切得到线性化粘性末端的克隆用载体骨架；

(2)、合成所需的miRNA的正反链引物，分别配成20uM浓度，按体积比正链：反链：10xT4DNA：灭菌无核酸酶H₂O＝1:1:1:7的配比取正链引物、反链引物加入10xT4DNA连接反应缓冲液，并在灭菌无核酸酶H₂O内混匀，95℃变性5分钟后，用每分钟5℃的速度降温退火至常温，得到双链带粘末端的miRNA表达小片段；

(3)、将步骤(2)中所得的miRNA表达小片段连接入步骤(1)中所得的线性化的骨架载体的2xBsmBI位点(200ul 96孔板中)：把退火产生的双链带粘末端的miRNA表达小片段稀释20倍后，取1ul，再加25ng mRRC载体骨架、1ul 10xT4DNA连接酶反应缓冲液、0.5ul T4DNA连接酶，用水补充到10ul总体积，16℃连接16小时；后加1.5ul NEBuffer4(10X)反应缓冲液、1.5ul 10mmol/l ATP、0.5ul Exonuclease V(5units)，37℃反应0.5小时，即得表达miRNA的AAV辅助包装载体。

进一步的，所述表达miRNA的AAV辅助包装载体的筛选方法，具体步骤包括：

(1)按上述步骤构建连接表达miRNA的AAV辅助包装载体；

(2)转化：用(1)中所述载体2～10ul转化Stbl3感受态细菌(ThermoFisher公司，货号C737303)20～100ul(2ml 96孔板)，42℃热激45～60秒后放冰上2分钟，再加1.5ml TB培养基在32度摇床培养20小时；取培养菌液1.2ml作无内毒素小量质粒提取；

(3)转染：将(2)中小量提取的质粒mRRC库与Ad辅助质粒pAd-deltaF6(载体来源：美国宾夕法尼亚大学载体部UPENN vector core PL-F-PVADF6)、能在广谱启动子CAG驱动下表达Gluc荧光素酶的带两端带有AAVITR序列的目的载体pITR-CAG..Gluc(表达Gluc荧光素酶，按现有技术自行构建)共转染293T细胞(293T，来源于CRL-3216TM)，使用培养基成份10％胎牛血清、2mM L-glutamine(ATCC 30-2214)、1％Penicillin/Streptomycin的高糖DMEM中(下文称为完全培养基)，在37℃，5％CO₂条件下培养48～72小时，设mRRC未插入miRNA的空载体作为对照样品；

(4)滴度比较筛选：整板细胞进行冻融循环3～4次；整板细胞4000g离心15分钟，取上清作悬浮感染：分2E+5～1E+6个293T细胞每孔到24孔板中，加入上清5～100ul，并加丁酸钠至终浓度2～50μmol/l；16小时后换为完全培养基200ul/孔，24小时后取上清检测Gluc酶活性强度，与对照相比量化倍数；确定能提高AAV产量30％以上的克隆，后用保存的菌种作平板划线培养，挑克隆菌测序确定miRNA序列。

进一步的，所述表达miRNA的AAV辅助包装载体在生产AAV中的应用。

一种利用表达miRNA的AAV辅助包装载体生产AAV的方法，具体步骤包括：

(1)、铺约1E+5个293T细胞至24孔板中，用完全培养基37℃，5％CO₂条件下培养16小时；

(2)、用所述表达miRNA的载体与Ad辅助载体pAd-deltaF6及pITR-CAG..Gluc载体各0.2～2ug，加入0.05～0.2ml DMEM中，再加入PEI 15ul(1ug/ul)，马上混匀，常温下放置10分钟后加入细胞培养基中；

(3)、培养72小时后收集细胞和上清，在37℃条件下和干冰中反复冻融三次，10000g离心10分钟后上清即为AAV粗提液；

(4)将(3)中所得AAV粗体液通过目前常用的碘克沙醇梯度超速离心或柱层析洗脱的方法制成AAV。

本发明有益效果：

本发明利用了一个高效的miRNA的表达骨架miR33的5’UTR及3’UTR来表达任意miRNA。基于这个骨架，合成所需的miRNA的正反链引物，退火形成连接入骨架的pre-miRNA表达小片段。

本发明用简化的载体构建及转染细胞的流程，实现高通量处理各环节，省去各个载体单独克隆及测序验证的步骤，实现用高通量的方法来筛选，从而在得到有效筛选结果的基础上节省大量资源与人力。实现提高AAV生产效率约50％以上。

本专利通过在三质粒转染的AAV生产方法中增加表达一个miRNA或shRNA，以增加AAV的生产效率。miRNA的选择基于一个载体筛选骨架：mRRC。本专利还创新地建立了一个简易但有效的载体构建方法，利用这个平台及简易方法构建了大量的miRNA或shRNA表达载体来实现提高AAV产量的高通量筛选。

附图说明

图1为本发明载体结构示意图。

图2为mRRC-miR375共转染后获得miR-375-AAV-Gluc感染293T细胞48小时后荧光素酶活性比较图：图中第一个柱形为无miRNA插入的mRRC空载体共转染后产生的对照Control-AAV-Gluc，第二个柱形为miR-375-AAV-Gluc；纵轴代表AAV感染后荧光素酶的活性比较，以第一个柱形为对照。

具体实施方式

为了更好地说明本发明所解决的问题、所采用的技术方案和所达到的效果，现结合具体实施例和相关资料进一步阐述。需要说明的是，本发明内容包含但不限于以下实施例及其组合实施方式。

本部分以miR375为例，对本发明技术方案作进一步说明。

实施例一 在mRRC载体上构建miRNA载体库作提升AAV产量的筛选

1、本发明的表达miRNA的载体，该载体在克隆位点处引入两个Type IIS限制性内切酶位点BsmBI，这类酶的特点在于切割位点与识别位点相距2～20个碱基，因此在同时引入两个识别方向相反的位点时，能在切割后把自身的识别序列去掉，产生精确切割后的粘末端用于插入片段连接，不残余对序列表达无用的序列。

2、本发明表达miR-375的载体的构建方法，具体步骤包括：

(1)用含有CMV-miR33-5’UTR-2xBsmBI-3’UTR表达盒的Rep/CapDJ辅助包装载体作为miR375表达克隆骨架载体，命名为mRRC，BsmBI酶切后，琼脂糖电泳回收得到线性化粘性末端的克隆用骨架；

(2)从引物公司合成所需的miR375的正反链引物：

miR-375-F：

5’-gcagccccgcgacgagcccctcgcacaaaccggacctgagcgttttgttcgttcggctcgcgtgaggc-3’

miR-375-R：

5’-gcctgcctcacgcgagccgaacgaacaaaacgctcaggtccggtttgtgcgaggggctcgtcgcgggg-3’；

配成20uM浓度，各取1ul加入1ul 10xT4DNA连接反应缓冲液，7ul H₂O内混匀，95℃变性5分钟后，用每分钟5℃的速度降温退火至常温，形成双链带粘末端的pre-miR375(SEQ>

(3)将所述pre-miR375表达小片段连接入上述骨架载体的2xBsmBI位点(200ul，96孔板中)：把退火产生的双链带粘末端的pre-miRNA表达小片段稀释20倍后，取1ul，再加25ng mRRC骨架载体、1ul 10x T4DNA连接酶反应缓冲液、0.5ul T4DNA连接酶，用水补充到10ul总体积，16℃连接16小时；后加1.5ul NEBuffer4(10X)反应缓冲液、1.5ul10mmol/lATP、0.5ul Exonuclease V(5units)，37℃反应0.5小时。

本方法用96孔板高通量并行操作载体构建。由于应用了Exonuclease V(RecBCD，NEB Cat#M0345S)，去除绝大部分未连接载体，只留下环状连接成功产物，防止线性的未连接成功质粒进入细菌后经过重组产生非目的片段插入的无用克隆，大大减少最终克隆背景，因此转化产物可不作铺板挑单克隆；以筛选得到提升AAV产量的结果为标准，得到阳性筛选结果后再测序确认其检测表达盒中的序列，节省绝大部分的克隆常规环节。相比之下，常规技术中由于占高比例的非目的克隆存在，需要要挑出多个克隆，经过小提质粒和测序，验证出正确克隆，再做转染、感染、筛选。本发明的高通量低背景克隆方法应用引入去除线性DNA的外切酶V，可去除绝大部分未连接载体，只留下连接成功产物，确保转化进入感受态细菌的基本是连接成功的环状连接产物，

现有技术中由于无关克隆的存在，需要挑出多个克隆，经过小提质粒和测序，验证出正确克隆，再做转染、感染、筛选。本发明的高通量克隆方法应用了核酸外切酶Exonuclease V，去除未连接载体，大大降低克隆背景，从而能够在不经挑克隆验证的情况下作下游实验的筛选工作。

3、本发明表达miRNA的载体的筛选方法，具体步骤包括：

(1)按上述步骤构建上述载体；

(2)转化：用(3)中所述连接产物载体2～10ul转化Stbl3感受态细菌(ThermoFisher公司，货号C737303)20～100ul(2ml 96孔板)，42℃热激45～60秒后放冰上2分钟，再加1.5ml TB培养基在32度摇床培养20小时；取培养菌液1.2ml作无内毒素小量质粒提取。

(3)转染：将(2)中小量提取的质粒mRRC库与Ad辅助质粒pAd-deltaF6(载体来源：美国宾夕法尼亚大学载体部UPENN vector core PL-F-PVADF6)、能在广谱启动子CAG驱动下表达绿色荧光蛋白的带ITR目的载体pITR-CAG..Gluc(表达Gluc荧光素酶，自行构建)、共转染293T细胞(293T，来源于CRL-3216^TM)，设mRRC未插入miRNA的空载体作为对照样品，37度5％CO细胞培养箱中培养48～72小时；

(4)滴度比较筛选：整板细胞进行冻融循环3～4次；整板细胞4000g离心15分钟，取上清作悬浮感染：分2E+5～1E+6个293T细胞每孔到24孔板中，加入上清5～100ul，并加丁酸钠至终浓度2～50μmol/l；16小时后换成完全培养基，200ul/孔，再过24小时后取上清检测Gluc酶活性强度，与对照相比量化倍数；确定能提高AAV产量30％以上的克隆，后用保存的菌种划线，挑克隆菌测序确定miRNA序列。

实施例二 利用表达miRNA的载体生产AAV的方法

实验材料：293T细胞，Ad辅助质粒pAd-deltaF6、AAV辅助包装质粒mRRC-375，ITR目的载体pITR-CAG..Gluc，PEI(1ug/ul)，DMEM高糖培养基。

1、提前分1E+5个293T细胞至24孔板中，用完全培养基37℃，5％CO₂条件下培养16小时；

2、用该mRRC-375载体与Ad辅助载体pAd-deltaF6及pITR-CAG..Gluc载体各0.2～2ug，加入0.5ml DMEM中，再加入PEI15ul(1ug/ul)，马上混匀，常温下放置10分钟后加入细胞培养基中；

3、72小时后收集细胞和上清，在37℃水浴和干冰中反复冻融三次，10000g离心10分钟后上清即为AAV粗提液。

对比实验：除mRRC载体替换为常规AAV生产用的RC载体外，其余的试剂与步骤完全一样。

利用本发明表达miRNA载体和常规载体感染293T细胞48小时后荧光素酶活性结果如图2所示，结果分析：本发明在原先生产AAV方法上无须作任何修改，仅仅替换原先的表达AAV复制蛋白Rep2和AAV-X血清型外壳蛋白(CapX)的载体RC(X)为mRRC(X)，即可达到提升AAV产量50％的效果。在AAV质量方面无明显差异。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

<110> 广州派真生物技术有限公司

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<210> 1

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

agggctctgc gtttgctcca ggtagtccgc tgctcccttg ggcctgggcc cactgacagc 60

cctggtgcct ctggccggct gcacacctcc tggcgggcag 100

<210> 2

<211> 100

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<212> RNA

<213> 人工序列

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ccccgcgacg agcccctcgc acaaaccgga cctgagcgtt ttgttcgttc ggctcgcgtg 60

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