结合siRNA技术的新型多价结核核酸疫苗的研究

摘要

结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)所致，以呼吸系统感染为主的慢性传染病。目前全球有1/3人口感染MTB，每年新发生的TB病例约1000万，每年约300万人因TB而死亡。我国TB患者数量居世界第二位，据2000年全国TB流行病学调查，我国现有MTB感染者4亿人，TB患者500万人，每年死于TB的人数达25.6万人。卡介苗(BCG)是目前唯一的预防TB的疫苗，但其保护效果不稳定(保护率为0-80％)，同时由于MTB耐药株的流行与HIV的合并感染以及人口流动的增加等因素，进一步加剧了MTB对人类的威胁，因此迫切需要研制新型的更有效的TB疫苗。 本研究采用PCR方法先后从MTB毒株H37Rv-DNA扩增出具有重要保护性抗原基因Ag85B和ESAT6，然后采用基因剪接重叠扩增PCR法(gene SOEing)将其通过疏水甘氨酸接头(GGIGIAPG)连接融合，定向克隆至质粒pVAxl中，构建结核分枝杆菌Ag85B-ESAT6融合抗原的真核表达质粒pVAxl/AE。在此基础上，我们对载体进行了一系列改造，通过PCR法将已构建质粒psiRNA/Mcl-1和人源pUMVC3-hIL12质粒上的siMcl-1和hIL12表达单位共同克隆入pVAXl/AE中，构建siMCL-1L，Ag85B-ESAT6融合抗原和hlL12的共表达真核载体，分别命名为pVAE、pVAE/siMcl-1、pVAE/Hil12和pVAE/siMcl-1/Hil12。并经单双限制性内切酶图谱、PCR及DNA测序分析等多种方法鉴定，证实共表达真核表达质粒构建成功。为进一步研究其结核核酸疫苗原型的免疫保护效果奠定了基础。 本文研制开发中的结核新型核酸疫苗，充分考虑了融合抗原、IL-12和Mcl-1L对保护效力的影响，并且在增强融合抗原和IL-12体内表达的同时，通过siRNA技术抑制抗凋亡基因Mcl-1L的表达，企求通过结核菌感染与机体免疫机制的多因子相互作用增强疫苗的保护效力，同时尝试结核病临床治疗新途径。这种方法的成功将为其它传染病的预防提供新思路和手段，具有普遍意义；为结核病的防治和研制优于BCG的更为有效的疫苗提供了基础。

目录

文摘

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第一章 绪论

第二章psiRNA/Mcl-1质粒的构建及鉴定

第三章 融合表达Ag85B-ESAT6抗原真核表达载体(pVAE)的构建及鉴定

第四章pVAE/siMc1-1质粒的构建及鉴定

第五章多重表达pVAE/Hil-12及pVAE/siMcl-1/Hil-12质粒的构建

结论与展望

参考文献

攻读学位期间发表的学术论文

致谢

附录