磷酸化Akt1(Thr308)位点突变真核表达载体的构建及其生物学功能研究

摘要

目的:构建磷酸化Akt1(Thr308)位点突变真核表达载体,并瞬时转染胃癌耐药细胞,对其生物学功能进行初步检测.方法:以带有pcDNA3.0-Flag标签的Akt1质粒为模板,采用重组PCR技术扩增得到Akt1(T308A)(苏氨酸突变成丙氨酸)、Akt1 (T308E)(苏氨酸突变成谷氨酸)位点突变编码区序列,将其插入pcDNA3.0-Flag载体,双酶切和测序验证后瞬时转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测其表达情况;将突变质粒与空载体分别转染人胃癌耐药细胞BGC-823/cDDP,通过Western印迹和实时定量PCR检测Notch1蛋白和mRNA水平的变化,通过CCK-8法检测对耐药细胞生长曲线的影响.结果:双酶切和测序结果表明Akt1(T308A)、Akt1(T308E)的真核表达质粒构建成功,转染293T细胞后获得表达;转染人胃癌耐药细胞BGC-823/cDDP后,利用实时定量PCR和Western印迹证明去磷酸化Akt1(T308A)可抑制Notch1的转录和蛋白水平,模拟持续磷酸化Akt1 (T308E)升高Notch1的转录和蛋白表达;细胞生长曲线结果显示,转染Akt1 (T308A)较空载体耐药细胞生长慢,而Akt1(T308E)促进耐药细胞生长.结论:PI3K/Akt与Notch1信号通路的激活在胃癌耐药的发生、发展过程中发挥重要作用.