重叠区扩增基因拼接法定点突变TGFBI及其真核表达载体的构建

摘要

本实验主要利用基因拼接定点突变TGFBI124位精氨酸并构建其真核表达载体。通过脱臼处死正常五周龄Balb/c鼠，取下角膜，提取总RNA，反转录为cDNA。根据需要突变位点来设计和合成突变引物，PCR合成TGFBI-WT全长2100bp，利用重叠区扩增基因拼接法先PCR扩增R124C,R124H, R124L突变的两个片段380bp和1720bp，然后大小片段分别共同变性退火延伸连接为TGFBI-R124C,TGFBI-R124H,TGFBI-R124L全长，TGFB凿生型全长和三个突变基因分别克隆至真核表达载体pcDNA3.1中，转化DH5a菌株，提取质粒，进行限制性内切酶鉴定和测序分析正确后，将质粒转染NH3T3细胞，48小时后提取细胞总蛋白，western blot检侧TGFBI蛋白表达水平。结果显示成功克隆了TGFBI-WT及三个突变基因TGFBI-R124C,TGFBI-R124H,TGFBI-R124L并成功构建了四个真核表达载体pcDNA3.1-TGFBI-WT,pcDNA3.1-TGFBI-R124C,pcDNA3.1-TGFBI-R124H和pcDNA3.1-TGFBI-R124L，转染NH3T3细胞后，TGFBI蛋白得到上调。