乙型脑炎病毒的实时荧光定量逆转录PCR检测方法的建立

摘要

目的 建立一种可以准确、快速、特异检测乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)的一步法实时荧光定量逆转录PCR (reverse transcription-quantitative real time PCR,RT-qPCR)体系. 方法 参照NCBI数据库的乙脑病毒全基因组序列,经过一致性比对分析,在乙脑病毒保守的3'非翻译区(3'untranslated region,3'UTR)区段,设计相应的特异性引物以及Taqman-MGB探针,优化检测体系及反应条件,建立一步法RT-qPCR方法.利用登革热、森林脑炎病毒、肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A16型(CoxA16)、狂犬病毒培养物和临床诊断为登革热及手足口病人的血清样本检测其交叉反应.选择15例疑似脑炎症状的病人血清样本,以国家食品药品监督管理总局(CFDA)批准的乙脑病毒检测试剂盒作对照试剂盒,检测其临床适用性. 结果 所建立的乙脑病毒一步法RT-qPCR检测方法重复性试验Ct值的变异系数CV在0.46％～0.53％之间,最低可检出5 copies/反应样本.检测体系与登革热、森林脑炎病毒等黄病毒及EV7I、CoxA16、狂犬病毒培养物等未发现交叉反应;64份临床诊断为登革热和手足口病人的血清样本检测也均为阴性.15份疑似乙脑感染的病人血清样本的检测结果与国家食品药品监督管理总局批准的乙型脑炎病毒检测试剂盒检测结果一致,但本方法操作步骤更少,检测时间更短. 结论 本实验建立的乙型脑炎病毒一步法实时荧光RT-qPCR检测方法具有较高灵敏度、特异性,可用于乙型脑炎病毒的检测.