猴三种逆转录病毒的三重实时荧光定量PCR检测方法

摘要

本发明公开了一种猴三种逆转录病毒的三重实时荧光定量PCR检测方法。选择猴免疫缺陷病毒SIV的gag基因、猴逆转D型病毒SRV1的5ˊLTR基因、猴T淋巴细胞趋向性病毒Ⅰ型STLV1的gag基因保守区序列作为检测靶序列，合成其DNA片段，并分别设计合成三对引物对及3条探针：SIV：上引物SI-F、下引物SI-R、探针SI-P，SRV1：上引物SR-F、下引物SR-R、探针SR-P，STLV1：上引物ST-F、下引物ST-R、探针ST-P，建立三重实时荧光定量PCR检测方法，可对三种猴逆转录病毒进行精确定性检测。本发明还涉及检测用试剂盒，具有检测特异性高、准确性高、灵敏度好的优点。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种猴三种逆转录病毒的三重实时荧光 定量PCR检测方法。

背景技术

猴免疫缺陷病毒(Simianimmunodeficiencyvirus，SIV)，也称为非洲绿猴病毒 (AfricanGreenMonkeyvirus)，是一种可影响至少33种非洲灵长目的逆转录病毒。SIV与 与HIV病毒在基因序列上有较高的同源性，非人灵长类感染SIV后，出现类似AIDS的发病机 制和临床症状表现，可在感染病毒后出现免疫系统的损害和多系统多器官组织的病变，SIV 在恒河猴体内分布较为广泛，可累及包括免疫系统在内的多个系统。

猴D型反转录病毒(simiantype-Dretrovirus，SRV)属反转录病毒科、D型反转录 病毒属，与猴免疫缺陷病毒(simianimmunodeficiencyvirus，SIV)同为猴获得性免疫缺 陷综合征(SAIDS)的一种致病病毒。目前已发现的SRV有5个血清型：SRV-1，2，3，4，5。SRV主 要的靶细胞是淋巴细胞，感染后可造成淋巴细胞耗竭，诱发免疫缺陷。各型SRV的发生有其 种属性和群体性，一旦传入易感猴群，可使80％以上的猴发病致死。

猴T淋巴细胞白血病病毒(simianT-lymphotropicvirus,STLV1)，与人T淋巴白 血病病毒(humanT-lymphotropicvirus,HTLV)统称为灵长类嗜T淋巴细胞病毒(primate T-lymphotropicvirus,PTLV)，均属于逆转录病毒属。猴T淋巴细胞趋向性病毒最初从亚洲 和非洲猴体内分离到，人工繁殖猴和野生猴均可被STLV1感染，但无临床症状表现。受STLV1 感染的非洲绿猴出现了与受HTLV感染的人相似的贫血症，并且STLV1与人的HTLV的遗传同 源性高达90-95％，有研究证明我国野生和饲养恒河猴血清广泛存在STLV1抗体。STLV1病毒 主要侵害猴的免疫系统，引起免疫器官的病变或免疫机能紊乱，从而干扰实验研究，是SPF 猴必须排除的几种病毒之一。

多重荧光定量PCR技术是在荧光定量PCR基础上发展起来的一个新技术，它强调在 同一个反应体系里同时扩增多个靶标。最近已有多项研究将多重定量PCR技术应用于病毒 检测领域。WeyerCT等建立了对非洲马瘟9种血清型分子分型的定性检测的三重实时荧光 PCR方法；HainesFJ等建立了同时检测古典猪瘟和非洲猪瘟多重实时荧光RT-PCR方法；许 建明等建立了同时检测三种鱼类弹状病毒的三重实时荧光PCR方法，结果显示多重PCR体系 与单一扩增结果在灵敏度和特异性方面基本相同。但是到目前为止，尚无报道有同时检测 SIV、SRV1和STLV1的试剂盒。

对于逆转录病毒而言，被该类病毒感染的动物常产生免疫抑制，导致血清中特异 性抗体水平偏低，造成抗体检测出现假阴性现象，实时定量PCR通过直接对感染动物的病原 体核酸特定片段进行扩增，检测扩增中荧光信号的强度变化，从而达到检测目的。该方法的 优势在于，直接对逆转录病毒的核酸进行检测，提高了检测的特异性；而对于逆转录病毒核 酸特定片段的扩增和放大，提高了检测的敏感性。

根据靶基因种内高度保守、种间高度特异的选择原则，经过序列BLAST比对分析， SIV的gag基因、SRV1的5'LTR基因、STLV1的gag基因作为检测靶基因的理想候选者。本发明 选取这三种基因作为靶基因，设计引物和探针，对设计的多对引物探针组合进行实验筛选 优化，获得最佳引物探针组合，建立了三重实时荧光PCR检测方法。

发明内容

基于以上不足之处，本发明的目的在于提供一种猴三种逆转录病毒的三重实时荧 光定量PCR检测方法及其专用引物、探针和基于该方法提供相应的试剂盒。该试剂盒可用于 猴逆转录病毒的检测。具体涉及同时检测实验猴的猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆转录病毒 (SRV1)和猴T淋巴细胞趋向性病毒1型(STLV1)。

一种能同时检测猴三种逆转录病毒三重实时荧光定量PCR的检测方法所需引物对 及探针，

猴免疫缺陷病毒SIV：

上引物SI-F:如序列表Seq.No1所示，

下引物SI-R:如序列表Seq.No2所示，

探针SI-P:如序列表Seq.No3所示；

猴逆转D型病毒SRV1：

上引物SR-F:如序列表Seq.No4所示，

下引物SR-R:如序列表Seq.No5所示，

探针SR-P:如序列表Seq.No6所示；

猴T淋巴细胞趋向性病毒Ⅰ型STLV1：

上引物ST-F:如序列表Seq.No7所示，

下引物ST-R:如序列表Seq.No8所示，

探针ST-P:如序列表Seq.No9所示。

本发明还具有如下技术特征：

1、一种能同时检测猴三种逆转录病毒三重实时荧光定量PCR的检测方法阳性对照 品的制备方法，包括如下步骤，

步骤(1)PCR模板的制备：SIV、SRV1、STLV1保守区基因序列的合成。

步骤(2)以步骤(1)中合成的各序列为模板，分别以上引物SI-F、下引物SI-R，上引 物SR-F、下引物SR-R，上引物ST-F、下引物ST-R为引物，进行目的基因的PCR扩增；

步骤(3)阳性对照品pMD18-SIV，pMD18-SRV1，pMD18-STLV1的制备：

步骤(2)中，目的基因的PCR反应体系如下：

引物各2μL，2×TaqMasterMix15μL，模板5μL，超纯水补足至30μL。

PCR的反应条件为：反转录50℃30min；95℃5min热启动，95℃15s，55℃25s，72℃延 伸15s，共进行40个循环；72℃延伸10min；

步骤(3)中，阳性对照品的制备过程，包括如下步骤：将步骤(2)中所得PCR产物分 别与克隆载体pMD-18-Tvector连接，转化大肠杆菌感受态DH5α，获得阳性克隆菌株，并制 备质粒pMD18-SIV，pMD18-SRV1，pMD18-STLV1作为阳性对照品。

2、如上所述一种能同时检测猴三种逆转录病毒三重实时荧光定量PCR的阳性对照 品，pMD18-SIV，如序列表Seq.No10所示；pMD18-SRV1，如序列表Seq.No11所示；pMD18- STLV1，如序列表Seq.No12所示。

3、一种能同时检测猴三种逆转录病毒三重实时荧光定量PCR的检测方法，PCR反应 体系如下：

RT-PCR反应液12.5μL，Taq酶0.5μL，RTMIX0.5μL，引物混合液(200nmol/L，分别包 含三种病毒的特异性引物比例为1:1:1)共3μL，探针混合液(100nmol/L，分别包含三种病毒 的特异性荧光探针，比例为1:1:1)共3μL，提取的样本核酸5μL作为反应模板，去RNAase Free水补足至25μL；

PCR的反应条件为：反转录50℃30min；95℃5min热启动，之后以95℃15s，55℃25s， 共进行40个循环。

4、一种能同时检测猴三种逆转录病毒三重实时荧光定量PCR的检测用试剂盒，包 括试剂如下，

引物对及探针：

猴免疫缺陷病毒SIV：

上引物SI-F:如序列表Seq.No1所示，

下引物SI-R:如序列表Seq.No2所示，

探针SI-P:如序列表Seq.No3所示；

猴逆转D型病毒SRV1：

上引物SR-F:如序列表Seq.No4所示，

下引物SR-R:如序列表Seq.No5所示，

探针SR-P:如序列表Seq.No6所示；

猴T淋巴细胞趋向性病毒Ⅰ型STLV1：

上引物ST-F:如序列表Seq.No7所示，

下引物ST-R:如序列表Seq.No8所示，

探针ST-P:如序列表Seq.No9所示；

阳性对照品：

pMD18-SIV，如序列表Seq.No10所示，

pMD18-SRV1:如序列表Seq.No11所示，

pMD18-STLV1:如序列表Seq.No12所示；

阴性对照品ddH2O、病毒核酸DNA/RAN提取试剂、实时荧光定量PCR扩增所需的RT- PCR预混液和Taq酶。

本发明的优势在于，能同时检测SIV、SRV1和STLV1三种病毒，直接对逆转录病毒的 核酸进行检测，提高了检测的特异性；而对于逆转录病毒核酸特定片段的扩增和放大，提高 了检测的敏感性。

附图说明

图1为三种重组阳性质粒PCR鉴定结果图。

图2为SIV病毒核酸标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线图。

图3为SRV1病毒核酸标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线图。

图4为STLV1病毒核酸标准品实时荧光定量RT-PCR标准曲线图。

图5为SIV三重qRT-PCR敏感性试验结果图。

图6为SRV1三重qRT-PCR敏感性试验结果图。

图7为STLV1三重qRT-PCR敏感性试验结果图。

图8为SIV、SRV1和STLV1三重qRT-PCR特异性试验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。

实施例1

目的基因的合成

根据GenBank公布的三种病毒中的序列，结合生物信息学手段，确定以SIV的gag基 因、SRV1的5'LTR基因、STLV1的gag基因保守区序列作为检测靶序列，合成其DNA片段，基因 合成由上海生工生物工程技术服务完成。病毒基因序列如表1所示。

表1：三种病毒的DNA序列

实施例2

特异性引物的合成

根据合成的三种病毒的基因序列，合成特异性引物，序列如表2所示。

表2：特异性引物序列

实施例3

阳性质粒的制备

1、PCR扩增目的基因

(1)扩增SIV基因：

PCR反应体系：引物各2μL，2×TaqMasterMix15μL，模板5μL，超纯水补足至30μL。

PCR的反应条件为：反转录50℃30min；95℃5min热启动，之后以95℃15s，55℃25s， 72℃延伸15s，共进行40个循环；72℃延伸10min。

(2)SRV1、STLV基因的扩增

PCR体系及反应条件如(1)所述。

2、阳性质粒的制备

分别将含有SIVgag基因、SRV15’LTR基因以及STLV1gag基因PCR扩增产物约为95- 139bp片断分别克隆至pMD18T载体(Takara)，具体操作过程如下：

(1)在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μL。

pMD18-TVector1μL

目的基因PCR产物1μL

ddH2O3μL

(2)加入5μL(等量)的SolutionⅠ。

(3)16℃反应30min。

(4)全量(10μL)加入至100μLDH5α感受态细胞中，冰浴30min。

(5)42℃加热45s，再在冰中放置1min。

(6)加入890μLSOC培养基，37℃振荡培养60min。

(7)在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、 蓝色菌落。

(8)挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。结果如图1所示。

(9)将筛选鉴定出的阳性克隆重组菌株增殖培养，提取重组质粒。将重组质粒分别 命名为pMD18-SIV，pMD18-SRV1，pMD18-STLV1。

(10)利用紫外分光光度计测定质粒浓度，按照常规试算公式：C＝[(N×6.02× 10²³)/(MW×10⁹)计算质粒拷贝数，其中N为质粒浓度，单位为ng/μL，C为每微升质粒提取溶 液中所含目的基因拷贝数；MW为克隆质粒分子量。

实施例2

三重实时荧光PCR检测方法的建立

根据三种病毒的基因序列设计探针，序列如下：

SIV(猴免疫缺陷病毒)基因探针：

SI-P:5’-(FAM)–CTCCTCTGCCGCTAGATGGTG-(BHQ1-3)-3’

SRV1(猴逆转D型病毒)基因探针：

SR-P:5’-(CY5)-CTCCAGGTTTCCTACTGTTGGT-(BHQ2-3)-3’

STLV(猴T淋巴细胞趋向性病毒Ⅰ型)基因探针：

ST-P:5’-(HEX)-ACAGGCCATTAAGCAA-(BHQ1-3)-3’

采用单因子浓度梯度实验法逐一改变实时荧光PCR反应体系中各组分浓度，以优 化实时荧光PCR反应体系，最终确定三重实时荧光PCR同时检测三种病毒的反应体系如下：

一步法：RT-PCR反应液12.5μL，Taq酶0.5μL，RTMIX0.5μL，引物混合液(200nmol/ L，分别包含三种病毒的特异性引物比例为1:1:1)共3μL，探针混合液(100nmol/L，分别包含 三种病毒的特异性荧光探针，比例为1:1:1)共3μL，提取的样本核酸5μL作为反应模板，去 RNAaseFree水补足至25μL。

PCR的反应条件参数为：反转录50℃30min；95℃5min热启动，之后以95℃15s，55℃ 25s，共进行40个循环。使用ABI7500荧光定量PCR进行检测。

实施例3

将已标定拷贝数的病毒标准品进行倍比稀释，浓度分别为10⁸-10²copies/mL进行 PCR扩增，以病毒核酸拷贝数为横坐标，以CT值为纵坐标，建立标准曲线。如图2、3、4所示，三 种病毒核酸的标准曲线分别具有良好的纯属关系。SIV、SRV1和STLV1的扩增效率(E)和相关 系数(r2)分别为：98.908％，0.989；95.115％，0.990；96.465％，0.998。

实施例4

方法的灵敏度试验

将含有目标病毒基因的克隆质粒进行标定，拷贝数调至SIV(10⁸copies/mL)、SRV1 (10⁸copies/mL)和STLV1(10⁸copies/mL)后分别进行梯度稀释(10³-10⁸copies/ml)，每个稀 释度做3个平行，反应条件按上述优化后的参考值进行荧光定量RT-PCR反应。以CT值作为纵 坐标，以样品拷贝数为横坐标PCR仪自动绘制标准曲线。结果显示，当将检测CT域值设为40 个循环值时，则所建立的三重实时荧光定量RT-PCR方法能检测到各病毒核酸样本的下限均 可达到10³copies/ml，说明敏感性良好。结果如图5、图6、图7所示。

实施例5

特异性试验

分别以含有SIV、STLV1、SRV1、猴B病毒(BV)和猴麻疹病毒(MV)的阳性血清或全血 样本作为参照进行目标病毒的荧光定量RT-PCR检测，同时观察标准品及阴性照有无扩增曲 线生成，以此验证本方法的特异性。结果显示，3种病毒均能特异地识别相应模板，并不与其 它参考病毒发生交叉反应，说明特异性较好。结果如图8所示。

实施例6

重复性试验

将不同稀释浓度的各病毒样本(10⁶、10⁵、10⁴)SIV、SRV1、STLV1按照上述条件进行 荧光定量RT-PCR检测，每种病毒每个稀释度重复6次，分别计算CT值、标准差(s)以及变异系 数(CV)。不同核酸浓度各自样本的检测CT值标准在1.12-2.3之间，变异系数均低于1％，说 明具有较好的重复性。

实施例7

实践应用

利用建立的三重实时荧光RT-PCR方法对采集的18份样品进行了SIV、SRV1和STLV1 核酸的筛查，共检测到SIV1份、SRV10份、STLV12份。利用单重实时荧光PCR检测方法进行验 证，符合率为100％，显示本发明方法具有良好的可靠性和实用性。

实施例8

试剂盒的组装

试剂盒中阴性对照品为ddH₂O，并包含病毒核酸(DNA/RAN)提取试剂、实时荧光定 量PCR扩增所需的RT-PCR预混液、Taq酶、引物和探针等试剂。

＜110＞海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心

＜120＞猴三种逆转录病毒的三重实时荧光定量PCR检测方法

＜160＞12

＜210＞1

＜211＞21

＜212＞DNA

＜213＞SI-F

＜400＞1

GAAACAGGAACAGCAGAAACT

＜210＞2

＜211＞23

＜212＞DNA

＜213＞SI-R

＜400＞2

ACCACCTATTTGTTGTACTGGGT

＜210＞3

＜211＞21

＜212＞DNA

＜213＞SI-P

＜400＞3

CTCCTCTGCCGCTAGATGGTG

＜210＞4

＜211＞20

＜212＞DNA

＜213＞SR-F

＜400＞4

GAGACTTGATCAGAACACTG

＜210＞5

＜211＞19

＜212＞DNA

＜213＞SR-R

＜400＞5

CGTGGCGTTGGATACGAGG

＜210＞6

＜211＞22

＜212＞DNA

＜213＞SR-P

＜400＞6

CTCCAGGTTTCCTACTGTTGGT

＜210＞7

＜211＞17

＜212＞DNA

＜213＞ST-F

＜400＞7

TCGCCCATGGCAAATGA

＜210＞8

＜211＞24

＜212＞DNA

＜213＞ST-R

＜400＞8

AGTTTATGCAGACCATCCGGCTTG

＜210＞9

＜211＞16

＜212＞DNA

＜213＞ST-P

＜400＞9

ACAGGCCATTAAGCAA

＜210＞10

＜211＞2789

＜212＞DNA

＜213＞pMD18-SIV

＜400＞10

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCA60

CAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTG120

TTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGC180

ACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCC240

ATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTAT300

TACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGT360

TTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCG420

ACGATTGAAACAGGAACAGCAGAAACTATGCCAAAAACAAGTAGACCAACAGCACCATCT480

AGCGGCAGAGGAGGAAATTACCCAGTACAACAAATAGGTGGTATCTCTAGAGGATCCCCG540

GGTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCC600

GCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTA660

ATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAA720

CCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTAT780

TGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCG840

AGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGC900

AGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTT960

GCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAG1020

TCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTC1080

CCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCC1140

TTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGT1200

CGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTT1260

ATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGC1320

AGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAA1380

GTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAA1440

GCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGG1500

TAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGA1560

AGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGG1620

GATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATG1680

AAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTT1740

AATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACT1800

CCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAAT1860

GATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGG1920

AAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTG1980

TTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCAT2040

TGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTC2100

CCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTT2160

CGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGC2220

AGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGA2280

GTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGC2340

GTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAA2400

ACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTA2460

ACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTG2520

AGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTG2580

AATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCAT2640

GAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATT2700

TCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAA2760

AAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC2789

＜210＞11

＜211＞2832

＜212＞DNA

＜213＞pMD18-SRV1

＜400＞11

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCA60

CAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTG120

TTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGC180

ACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCC240

ATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTAT300

TACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGT360

TTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCG420

ACGATTGAGACTTGATCAGAACACTGTCTTGTCTCCATTTCTTGTGTCTCTTGTCCCATC480

CAATTCCCACTCCCTCCTCCAGGTTTCCTACTGTTGGTCCCGCGGGACGGGACATTTGGC540

GCCCAACGTGGCGTTGGATACGAGGATCTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATT600

CGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACA660

ACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCA720

CATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGC780

ATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTT840

CCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACT900

CAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAG960

CAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATA1020

GGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACC1080

CGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTG1140

TTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGC1200

TTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGG1260

GCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTC1320

TTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGA1380

TTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACG1440

GCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAA1500

AAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTG1560

TTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTT1620

CTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGAT1680

TATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCT1740

AAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTA1800

TCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAA1860

CTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCAC1920

GCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAA1980

GTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAG2040

TAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGG2100

TGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAG2160

TTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTG2220

TCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTC2280

TTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCAT2340

TCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATA2400

CCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAA2460

AACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCA2520

ACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGC2580

AAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCC2640

TTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTG2700

AATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCAC2760

CTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGA2820

GGCCCTTTCGTC2832

＜210＞12

＜211＞2788

＜212＞DNA

＜213＞pMD18-STLV1

＜400＞12

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCA60

CAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTG120

TTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGC180

ACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCC240

ATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTAT300

TACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGT360

TTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCG420

ACGATTTCGCCCATGGCAAATGAAAGACCTACAGGCCATTAAGCAAGAGGTCTCCCAAGC480

AGCCCCTGGGAGCCCCCAGTTTATGCAGACCATCCGGCTTGATCTCTAGAGGATCCCCGG540

GTACCGAGCTCGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCG600

CTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAA660

TGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAAC720

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GGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGA840

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GGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTG960

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GTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTA1260

TCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCA1320

GCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAG1380

TGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAG1440

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ATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGA1680

AGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTA1740

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CCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATG1860

ATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGA1920

AGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGT1980

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