乙型脑炎病毒纳米PCR检测方法的建立及减毒株SA14-14-2序列的分析

摘要

流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)又称日本脑炎，简称乙脑，是由乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的一种急性人兽共患传染病。JEV属于黄病毒科(Flaviridae)黄病毒属(Flavivirus)，为单股正链RNA病毒。本研究根据已发表的JEV减毒株SA14-14-2全基因序列设计合成5对引物，扩增出覆盖JEV仝基因的5个片段，并成功克隆至pEASY-Blunt载体上，经测序拼接获得JEV全基因组序列。结果表明，JEV全基因组长10977 bp，除5'端95个核苷酸和3'端385个核苷酸为非编码区以外，其余10296个核苷酸编码一个丌放阅读框(ORF)，依次编码以下蛋白:C、PrM、E三个结构蛋白和NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5七个非结构蛋白。将此全序列与已发表的SA14源毒株核苷酸及氨基酸序列进行比较分析，其同源性均为99％以上。并发现10701位有碱基G的插入，多数其他已发表的序列均有此情况发生，这可能是传代过程中为适应环境而引起的自然突变。测定SA14-14-2株全基因序列，不仅为开展基因工程疫苗研究奠定基础，为应用于生产的减毒活疫苗的质控提供了宝贵的材料，也为进一步构建感染性克隆奠定工作基础。
　　纳米PCR技术是一种新型的PCR技术，其原理是把粒径为1 nm～100nm的固相纳米金属颗粒悬浮在液体中形成纳米流体。JEV的E基因编码JEV的囊膜糖蛋白(envelope glycoprotein)，E蛋白是病毒颗粒表面最重要的成分，有多个抗原表位，在病毒入侵宿主中起到重要作用。本研究根据JEV E基因的保守区域设计一对扩增270 bp片段的特异性检测引物，将纳米金颗粒添加到PCR反应体系中，同时优化反应条件，首次建立了高效、灵敏的纳米PCR检测方法。采用该方法灵敏度可达1.96×102 copies，普通PCR方法仅为1.96×104 copies，且与其他病毒没有交叉感染。由丁纳米材料具有良好的热传导性，因此在添加了纳米金颗粒的PCR循环体系中，PCR反应会更快地达到目标温度，减少了在非目标温度的停留时间，进而缩短整个体系达到温度平衡所用的时问，减少非特性扩增，提高特异性扩增产量。通过试验研究表明，该纳米PCR检测方法不仅特异性好，而且其敏感性是普通PCR检测方法的100倍。果用纳米PCR方法和普通PCR方法对临床送检的32份样品进行检测，检测结果纳米PCR检出2份阳性样品，普通PCR检测均为阳性。研究表明，该检测方法不仅为JEV的检测提供一个新的技术，同时对其早期检测和预防奠定基础。

目录

声明

摘要

缩略表

试剂列表

仪器列表

1 引言

1．1 乙型脑炎病毒概述

1．1．1 乙型脑炎病毒的流行现状

1．1．2 乙型脑炎病毒病原学特性

1．1．3 乙脑的检测方法

1．1．4 JEV的致病机制

1．2 纳米PCR技术

1．2．1 纳米PCR的概述

1．2．2 纳米PCR的优化机制

1．3 小结

2 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 毒株

2．1．2 细胞及载体

2．1．3 主要试剂

2．1．4 细胞培养用液

2．2 方法

2．2．1 引物设计

2．2．2 病毒RNA的提取及cDNA的合成

2．2．3 E基因阳性模板质粒的构建

2．2．4 JEV纳米PCR检测方法的建立

2．2．5 扩增体系的优化

2．2．6 特异性试验

2．2．7 重复性试验

2．2．8 敏感性试验

2．2．9 临床样品的检测

2．2．10 乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2全序列的测定分析

3 结果与分析

3．1 结果

3．1．1 目的片段的扩增

3．1．2 反应体系及扩增条件的优化

3．1．3 特异性试验结果

3．1．4 重复性试验结果

3．1．5 灵敏性试验结果

3．1．6 临床样品检测结果

3．1．7 乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2全序列的测定分析结果

3．2 小结

4 讨论

4．1 乙型脑炎病毒纳米PCR检测方法的建立

4．2 乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2全序列的测定分析

5 结论

参考文献

攻读硕士期间发表的学术论文

作者简历

致谢