规模化制备高纯度牛奶外泌体工艺方法的建立及其分子与细胞生物学活性鉴定

摘要

目的:建立一种规模化的牛奶外泌体纯化工艺,用于实验室制备和工业规模生产,并评价牛奶外泌体的分子与细胞生物学活性.方法:取市售多种全脂或脱脂牛奶,以外泌体提取金标准——超速离心法(UC)作为对照,采用多种化学前处理方法去除乳蛋白,切向流超滤技术(TFF)进一步去除残留的乳蛋白,并实现牛奶样品的初纯与浓缩,多模式色谱法(BE-SEC)精纯牛奶外泌体,采用纳米流式细胞术(NanoFCM)检测牛奶外泌体的粒径、颗粒浓度和纯度,透射电子显微镜(TEM)观察牛奶外泌体的形态表现,高效液相色谱(HPLC)验证牛奶外泌体的尺寸和纯度,Western blotting法检测牛奶外泌体特异性蛋白的表达,基因本体(GO)富集分析差异表达微小RNA(miRNA)的候选靶基因,DAVID Bioinformatics Resources 6.8和KOBAS软件检测京都基因和基因组百科(KEGG)通路中目标候选基因的统计富集度,CytoFlex流式细胞术检测细胞对牛奶外泌体的摄取情况,流式细胞术检测牛奶外泌体作用后Caco-2细胞凋亡率.结果:工艺研究,磷酸钠沉淀法在操作便利性、方法稳定性和产品质量方便均优于其他预处理方法.TFF法可进一步去除残留乳蛋白并可实现液体浓缩目的,有效衔接至下游BE-SEC精纯方法.以该三步工艺所得外泌体样品经TEM成像显示均呈典型的盘状或杯状外泌体形态.NanoFCM法检测的样品粒径为30～150 nm,且优于UC所得外泌体样本纯度.Western blotting法检测,确定外泌体样品含有CD81、Alix和TSG101等外泌体特异性标志物.SEC-HPLC分析,不同批次终产物均为单一均质峰,无游离蛋白污染.GO与和KEGG数据库分析,牛奶外泌体富含免疫相关蛋白与炎症反应调节信号通路相关miRNA.上述制备工艺所得外泌体具备高效穿透细胞膜的能力,4 h内入胞比例达99％.结论:建立了一套由化学沉淀前处理、TFF和BE-SEC三步结合的牛奶外泌体高纯度制备工艺方法.该工艺方法所得牛奶外泌体纯度、产率均优于金标准——UC所得样品.样品理化性质符合典型牛奶外泌体标准,可在数小时内穿透细胞膜,并富含免疫与炎症反应调控相关miRNA.