重组人HIF-1α真核表达质粒的构建和鉴定

摘要

目的:构建重组人HIF-Ia真核表达质粒,为进行人HIF-1α基因的克隆与表达做准备.方法:从人外周血细胞中提取总RNA,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法反转录合成cDNA.分别以含有绿色荧光蛋白(EGFP)片段的质粒PIREGFP质粒和反转录合成的cDNA为模板,加入所设计的3对引物[EGFP-linker、HIF-1α)上游(up)和下游(down)引物]所扩增目的基因片段分别与T载体连接后转化大肠杆菌DH5α,LB/Amp平板培养基筛选菌落,提取质粒.测序正确后经酶切先后克隆进入pVAXl载体.结果:通过聚合酶链反应(PCR)分别获得约870、1 199和672 bp的特异性DNA片段,分别与T载体连接后测序,测序结果与GenBank所提供的基因序列相同.将以上3个片段依次连入pVAXl载体后,所得质粒经酶切鉴定后获得约1 800 bp片段,与预想结果一致.结论:成功构建了重组人HIF-1α真核表达质粒pVAxl-EGFP-linker-HIF-1α.