重组人HIF-1α反义RNA腺相关病毒载体质粒的构建和鉴定

摘要

目的：构建重组人HIF-1 α反义RNA腺相关病毒载体(raav-As HIF-1α)，为利用其进行抑制胶质瘤血管再生及治疗研究作准备。 方法：从胶质瘤术后冻存标本或U251胶质瘤细胞中提取总RNA，以RT-PCR法反转录合成cDNA。设计两对带有酶切位点引物进一步扩增出携带HIF-1α反义RNA的目的基因片段，酶切后将其在T4连接酶作用下反向与PAAV-Mcs载体连接，再通过分离浓缩和纯化重组腺相关病毒载体，获得较高的病毒滴度。 结果：提取RNA经检验后，通过RT-PCR获得HIF-1 α在电泳中可见一条清晰494bp条带后经胶回收得高纯度目的基因，将质粒及目的基因经过双酶切后用连接酶连接后转染入XL10大肠杆菌中过夜可见培养皿中菌落生成，挑克隆经腺相关病毒通用引物PCR扩增可见一长约700bp条带并经测序鉴定，获得的目的基因分子序列包含有HIF-1 α反义RNA，且反向插入PAAV-Mcs载体EcoR I，Xhol部位正确，再通过包装分离浓缩和纯化重组腺相关病毒载体，获得较高的病毒滴度。 结论：成功通过RT-PCR获得含目的基因的片段；经测序鉴定，成功获得包含有HIF-1 α反义RNA序列，且反向插入。PAAV-Mcs载体EcoR I，Xhol位点的重组质粒；成功获得人HIF-1 α反义RNA腺相关病毒，为利用其进行胶质瘤血管再生的抑制研究及进一步进行胶质瘤治疗作准备。

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