人端粒酶催化亚基反义RNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

摘要

[目的]
　　 病理性瘢痕包括增生性瘢痕与瘢痕疙瘩，其形成过程受到各种因素的影响。一般认为它们是由创伤引起，以成纤维细胞的过度增生及胶原等大量细胞外基质的过度产生和沉积为特征的皮肤纤维增生性疾病。病理性瘢痕的发病机理至今不甚清楚，但以往大量研究表明瘢痕的过度增生与细胞因子、癌基因和免疫反应等密切相关。越来越多的研究表明人端粒酶催化亚基(human telomerase reversetranscriptase，hTERT)具有逆转录酶活性，在癌细胞或永生化细胞中高表达，是端粒酶活性的重要决定因素。重组腺病毒载体是目前应用最广泛的生物病毒载体之一，与其他病毒载体系统比较，具有明显优点：能将外源基因高效导入哺乳动物细胞；其转染不依赖细胞分裂，既可转染分裂期细胞，又可转染非分裂期细胞；携带的外源基因不与宿主基因整合，对人致病性低。这些优点使其成为一种高效而安全的基因转移工具，广泛应用于基因治疗的研究。本实验构建含有人端粒酶催化亚基中c-myc原癌基因结合位点的反义RNA的重组腺病毒载体，为下一步转染瘢痕疙瘩成纤维细胞，观察hTERT在细胞中表达后对细胞增长的影响奠定实验基础。
　　 [方法]
　　 1.按照人工合成中反向转录的方法设计基因合成引物，用复式PCR获得目的片段ashTERT(322bp)。
　　 2.将片段ashTERT克隆到pUC57(2.7kb)克隆载体，然后热激转化到E.coli感受态细胞中，菌检、PCR、鉴定阳性克隆后，菌液放大培养，提取质粒pUC57-ashTERT，然后对质粒进行测序。
　　 3.将目的基因片段亚克隆到穿梭载体pShuttle-CMVneo上，然后构建重组腺病毒质粒pAd-ashTERT。
　　 4.转入293细胞中进行病毒包装、鉴定和滴度测定。
　　 [结果]
　　 1.应用overlapping PCR获得目的基因片段经1％琼脂糖凝胶电泳显示扩增片断约为322bp，与目的片断大小基本符合，且无非特异性扩增。
　　 2.腺病毒穿梭质粒pUC57-ashTERT经限制性内切酶KpnI酶切后电泳见大约307bp片段，与目的片断符合，再连接到pShuttle-CMVneo穿梭载体上热激转化克隆后提取质粒pShuttle-ashTERT，测序结果表明克隆得到的序列符合设计要求。
　　 3.同源重组腺病毒质粒pAd-ashTERT经PacI酶切后电泳，可见约30kb的大片段和约4.5kb或3.0kb的小片段。
　　 4.重组腺病毒质粒pAd-ashTERT经质脂体转染293A细胞，两周后抽提病毒液腺病毒基因组DNA，PCR检测到条带大小为286bp的片段。
　　 5.测病毒滴度：约为4.2×109 PFU/ml
　　 [结论]
　　 成功构建了有较强感染能力的含hTERT反义RNA基因的重组腺病毒载体。