人HIF-1α基因RNAi重组腺病毒的构建及对人肺腺癌SPCA-1细胞HIF-1α表达的影响

摘要

目的 构建人HIF-1α基因RNAi重组腺病毒Ad.HIF-1α,并观察其对人肺腺癌细胞SPCA-1的影响.方法 采用酶切、连接、转化等方法,利用AdEasy系统构建插入HIF-1α RNAi片段的重组腺病毒Ad.HIF-1α.氯化铯梯度离心法纯化病毒.病毒功能滴度采用传导293细胞的方法,以2 MOI Ad.HIF1α传导SPCA-1细胞,48 h后应用流式细胞术检测绿色荧光蛋白(GFP)表达和HIF-1α蛋白表达.HIF-1α mRNA表达用荧光定量PCR检测.结果 酶切和卡那霉素抗性筛选证实,重组穿梭载体pAdTrack.HIF-1α和腺病毒质粒pAd.HIF-1α均构建正确.pAd.HIF-1α导入293细胞3 d,约15%的细胞表达GFP,最终所获病毒滴度为5.0×1010TU/mL.Ad.HIF-1α转导SPCA-1细胞48 h,GFP表达率为92%;HIF-1α mRNA和蛋白表达分别下降89%和87%.结论 成功构建人HIF-1α基因RNAi腺病毒,为通过阻断HIF-1α基因治疗肺癌提供初步实验依据.