耐热AKP在高GC含量细菌染色体杂交方法中的应用

摘要

目的：应用耐热碱性磷酸酶(AKP)于微孔板DNA—DNA杂交技术，建立高G+C含量细菌染色体DNA同源性测定的特异性方法，为此类细菌的分类与鉴定奠定基础。方法：细菌染色体DNA经分离纯化并变性后，直接非共价结合于固相微孔板中，与标有光标生物素的DNA探针进行杂交。借助抗生物素蛋白与生物素的特异性结合，通过与板上带有生物素的杂交体作用，使得链霉亲和素连接的耐热AKP固定于板上，根据底物加入后的酶促反应强度，定量判读杂交结果。结果：微孔板中1μg/孔DNA的包被浓度与25～50ng／孔的生物素探针呈现较为理想的杂交结果，pH9．5 Tfis—Hcl缓冲液系耐热AKP的最佳作用条件。应用该法于高G+C含量的分枝杆菌种间染色体同源性分析表明，方法具有敏感、特异、简便等优点。结论：耐热AKP应用于微孔板定量杂交，可不受较高杂交和测定温度的影响，适用于高G+C含量的结核杆菌等分枝杆菌属以及假单胞菌属的定性检测和同源性的定量分析。