人突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定

摘要

目的: 构建人突变型低氧诱导因子1(HIF-1)α腺病毒表达载体,研究人突变型HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用. 方法: 采用分子克隆技术,由pcDNA3.1(+)-HIF1α(突变型)质粒获得突变型HIF1α cDNA,克隆到穿梭质粒pShuttle2,以PI-Sce I和I-Ceu I双酶切重组穿梭质粒,获得含有突变型HIF1α cDNA的表达盒,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-X Viral DNA连接,重组成pAdeno-HIF1α腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,在HEK293细胞中包装成为重组Adeno-HIF1α腺病毒,并进行PCR鉴定及滴度测定. 结果: 经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功,包装后冻融细胞的上清PCR检测重组腺病毒包装成功,病毒滴度为2×1012 pfu/L. 结论: 成功构建重组腺病毒Adeno-HIF1α(突变型),为冠心病的突变型HIF1α基因治疗研究奠定基础.