Flag与GFP双标记人微粒体甘油三酯转移蛋白重组腺病毒载体的构建与表达

摘要

目的 利用重组腺病毒(adenovirus,ad)技术Adeasy系统构建带绿色荧光蛋白(Greenfluorescence protein,GFP)和Flag双标记的人类微粒体甘油三酯转移蛋白(human microsomal triglyceridetransfer protein,hMTP)基因重组腺病毒载体,并包装成高滴度的腺病毒.方法 自人HepG2细胞获得RNA,以RT-PCR和Nested PCR扩增hMTP-flag基因.PCR产物经测序证实后插入穿梭质粒GFP-Track.经PmeI酶切线性化后,共转化到含腺病毒骨架质粒Adeasy的感受态细菌BJ5183.筛取阳性克隆,经PacI酶切线性化后转染293A细胞,产生包装病毒颗粒,并传代扩增培养.结果 经测序证实得到hMTP-flag-GFP基因,限制性内切酶证实同源重组腺病毒包含目的 基因.荧光显微镜下可见GFP的高效表达,Western-blot检测可见97KD目的 条带(hMTP分子质量为97KD).结论 成功构建含hMTP-flag-GFP基因的双标记重组腺病毒载体,并进行蛋白质表达,为进一步研究脂蛋白的功能打好了坚实基础.