北京棒杆菌新型天冬氨酸激酶双突变株Y198N/D201M的构建及酶学性质表征

摘要

利用定点突变提高天冬氨酸族氨基酸合成途径中的首个关键别构酶天冬氨酸激酶(aspartate kinase,AK)活力,并解除其受到代谢产物赖氨酸(Lys)与苏氨酸(Thr)的协同反馈抑制.在获得北京棒杆菌单体AK并分析结构的基础上,选取ATP周围的关键残基位点Tyr198和Asp201进行饱和定点突变,采用高通量筛选方法成功获得了酶活力提高到18.26?倍的双突变体Y198N/D201M,动力学结果显示,Km值由野生型(wild?type,WT)的3.58?mmol/L减小到2.37?mmol/L,与底物亲和力增强;n值由WT的1.91减小到1.58,正协同性降低.酶学性质研究表明:双突变体Y198N/D201M最适反应温度由WT的25?℃增至28?℃,最适pH值由WT的8.0降至7.5,半衰期由WT的4.66?h延长至5.32?h.突变体Y198N/D201M较WT,在各个抑制剂浓度下活性抑制作用表现出不同程度的减弱,甚至在5?mmol/L和10?mmol/L?Lys+Met、Thr+Met和Lys+Thr+Met条件下有激活作用.