北京棒杆菌单体天冬氨酸激酶T379N/A380C/T65I/D173G突变体酶学性质表征及工程菌构建

摘要

选取天冬氨酸激酶抑制剂赖氨酸(Lys)的结合位点苏氨酸(Thr)379和丙氨酸(Ala)380、底物天冬氨酸(Asp)的结合位点Thr65、既是底物也是ATP结合位点的催化活性中心Asp173,对4个关键残基位点进行定点饱和突变。采用高通量筛选方法成功构建突变体T379N/A380C/T65I/D173G,与野生型(wild type,WT)相比,酶活力提高到75.83倍。动力学与酶学性质表征显示:相比于WT,K;值由4.11 mmol/L降低至1.34 mmol/L,表明与底物亲和力增强;n值由1.71减小到1.07,正协同性降低。突变体T379N/A380C/T65I/D173G最适反应温度由WT的25℃提高到30℃,最适pH值与WT相同均为8.0,半衰期由WT的4.24 h缩短至3.23 h。突变体在0.2~10 mmol/L抑制剂浓度下,抑制作用整体减弱,尤其在Lys和Lys+Thr作用下明显激活。通过无缝克隆技术电转入北京棒杆菌构建工程菌,发酵测得Lys产量相比WT提高83.05%,Thr提高29.36%,甲硫氨酸(Met)提高30.77%,为优化天冬氨酸激酶代谢途径和构建高产天冬氨酸族氨基酸菌株提供参考。