基于blaCARB-17基因建立水产品中副溶血弧菌的环介导等温扩增技术检测方法

摘要

以 β内酰胺酶编码基因-17(class A carbenicillin-hydrolyzingβ-lactamase family-17,blaCARB-17)为靶标,建立一种检测水产品中副溶血弧菌的高特异性环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术.用Bacillus stearothermophilus(Bst)DNA聚合酶于63℃反应60 min,扩增副溶血弧菌ATCC17802的blaCARB-17基因,产物用质量浓度20 g/L琼脂糖凝胶电泳和SYBR Green I染色鉴定,优化体系的主要参数.用5株食源性病原菌作对照,验证体系的特异性;将基因组倍比稀释确定其灵敏度;稀释菌液涂抹新鲜虾样品做污染模拟实验,并对实际样品检测分析其可靠性.优化后体系中Mg2+最适浓度为2.4 mmol/L,dNTPs最佳反应浓度是0.96 mmol/L,Bst DNA聚合酶最适用量是4.8 U,内外引物浓度比是8:1,最佳反应条件是65℃、60 min.特异性实验显示仅副溶血弧菌为阳性;体系最低检测限为3.64×102 ng/μL;模拟实验的最低检测限为10 CFU/mL;实际样品LAMP检测与PCR符合率100％.该研究建立的LAMP方法操作简便、特异性强、灵敏性高,可用于现场快速检测副溶血弧菌.