环介导等温扩增技术

摘要： 为建立检测鸭坦布苏病毒(DTMUV)的荧光逆转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测方法,根据DTMUV NS5基因保守序列设计1套特异性引物,对反应时间和温度进行优化,并评价该方法的特异性、敏感性、重复性和临床适用性。结果显示:建立的荧光RT-LAMP最优反应条件为65°C25 min;只特异性扩增DTMUV,而不扩增其他几种禽类病毒;最低检测限为4×10^(2)copies/μL,与qRT-PCR方法敏感性一致,是普通RT-PCR的100倍;批内和批间重复性高;应用该方法检测DTMUV不同剂量人工感染鸭肝脏样品,对接毒剂量为10^(3-7)TCID_(50)和10^(2-7)TCID_(50)组的阳性检出率均为100%,对接毒量10^(1.7)TCID_(50)组的阳性检出率为90%(9/10)。结果表明,本研究建立的荧光RT-LAMP检测方法特异性强、重复性好、敏感性高,可成为快速诊断DTMUV的方法之一。

摘要： 研究基于弧菌属16S rRNA保守基因片段设计引物,利用恒温条件进行扩增,建立并优化了弧菌属环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,在LAMP检测方法最优条件下,验证LAMP方法的特异性、灵敏度和实际应用性。结果表明:最佳反应条件为反应温度61°C、Mg^(2+)、dNTPs和甜菜碱的浓度分别为4 mmol/L、1.8 mmol/L和0.4 mol/L;在最佳检测条件下,以4种弧菌(溶藻弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌)和8种其他菌株作为验证模板,发现该方法仅对弧菌有阳性扩增结果,证明该方法具有较高的特异性;同时,该方法对创伤弧菌DNA的最小检出量为940 fg/μL,其检测下限比常规PCR法降低了2个数量级。该研究成功建立了弧菌属细菌的快速检测方法,且方法具有良好的特异度和敏感度,为弧菌的快速检验提供了技术支撑。

摘要： 烟草黑胫病由烟草疫霉菌引起,发病率高,危害严重,是困扰我国烟草生产的主要病害之一。本研究采取环介导等温扩增技术(LAMP),针对烟草疫霉菌特有的半胱氨酸蛋白酶基因PpCys45设计了4条引物,在PCR仪中对贵州省收集的2个烟草疫霉菌菌株的DNA进行检测,在普通水浴锅中对感染黑胫病的烟草组织进行检测。结果表明,2个菌株的DNA均可以通过LAMP反应产生绿色荧光,感染黑胫病的烟株根部组织和茎基木质部组织也可以直接通过LAMP反应产生绿色荧光。由此得出,本研究针对烟草疫霉菌特异的致病因子半胱氨酸蛋白酶开发的LAMP体系,利用普通水浴锅就可以直接针对感染黑胫病的烟株组织完成检测反应,为该病害在基层站点的检测提供了方便。

摘要： 为了建立快速简便的fneB-LAMP检测法用于马腺疫病原马链球菌马亚种(S.equi)的检测,本试验采用恒温水浴进行LAMP扩增,建立可视化fneB-LAMP检测方法。结果显示:对大肠埃希菌、无乳链球菌、金黄色葡萄球、蜡状芽孢杆菌和克雷伯杆菌5种菌与标准S.equi菌株检测,只能够检测出标准阳性菌株;对新疆昭苏县3个马场临床检查疑似马腺疫的鼻拭子和脓汁共40份样品进行fneB-LAMP检测,其中有7株分离菌呈阳性;与普通PCR检测方法相比,LAMP检测方法灵敏度为8×10^(-6)μg/μL,较普通PCR方法高;该方法在粗提模板的情况下只需简单的恒温仪器反应1 h可得到可视化的检测结果。本试验成功建立了马腺疫病原靶向fneB基因LAMP检测的方法,能够快速准确的检测出S.equi,为今后快速诊断马腺疫疾病提供参考。

摘要： 建立了一种基于环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)和核酸分子"光开关"[Ru(phen)_(2)dppz]^(2+)相结合的新型冠状病毒高灵敏可视化检测方法。分别采用保温杯代替实验室恒温装置,采用蓝光手电代替蓝光透射仪,实现了新冠病毒的现场快速可视化LAMP检测。针对新型冠状病毒N基因设计特异性序列引物,采用[Ru(phen)_(2)dppz]^(2+)分子光开关的特性检测LAMP扩增产物,结果可以借助蓝光手电直接通过肉眼观察是否出现红色荧光进行判定。该方法可检测到单个拷贝数的新型冠状病毒基因片段,并具有高度特异性,检验快速,整个过程仅需40min即可目视观察结果。对新冠病毒假病毒人工污染的模拟冷链食品进行检测,结果与目前新型冠状病毒检测金标准实时荧光定量PCR法吻合度为100%。该方法仅需保温杯和蓝光手电,可以作为实时荧光PCR方法的补充,为食品新冠病毒的现场筛查提供快速高效的技术支持。

摘要： 为果蔬斯高维尔炭疽菌检测提供高效便捷、特异性好、可视化的检测方法,以果蔬斯高维尔炭疽菌内部转录间隔区ITS序列为靶基因,设计4条LAMP引物和1条环引物,通过对引物比例、反应时间、反应体系等条件的选择,建立对果蔬斯高维尔炭疽菌具有特异性扩增的LAMP检测方法。特异性试验结果显示:所建立的LAMP反应体系在最佳反应温度65°C条件下扩增60 min,以果蔬斯高维尔炭疽菌DNA为模板的反应体系在指示剂钙黄绿素和羟基萘酚蓝的作用下,分别呈现绿色和蓝色,反应结果为阳性,扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测呈梯形条带;而以其他8株对照菌株DNA为模板的反应体系和空白对照分别呈现橘黄色和紫色,均为阴性反应,无扩增条带出现,表明该LAMP检测方法对果蔬斯高维尔炭疽菌特异性强。

摘要： 环介导等温扩增技术(LAMP)具备特异性好、灵敏度高、方便快捷的特点,目前已经广泛用于医学诊断、食品安全检测、植物病虫害检测等基因芯片领域。为植物病毒病的早期预防提供技术支撑,介绍了LAMP技术的原理、特性、在植物病毒检测中的应用以及该技术在植物病害检测中的发展前景。

摘要： 为建立一种适用于猪圆环病毒2型(PCV2)现场、快速、可视化检测方法,本研究根据PCV2ORF1基因中的保守序列设计合适的环介导等温扩增(LAMP)引物对,优化反应体系及条件,并评估该方法的灵敏度和特异性。结果显示,63°C恒温扩增45 min即可出现梯形条带,检测下限为1.0×10^(1)copies/μL,较普通PCR敏感性提高100倍,且当产物中加入SYBR GreenⅠ染料后可实现可视化检测。应用该方法对72份临床样品进行检测,结果显示,PCV2阳性率为47.2%(34/72),与qPCR检测的符合率为98.6%(71/72),与普通PCR的符合率为94.4%(68/72)。结果表明,该基于LAMP的检测方法具有敏感特异、简便快捷、可视化的特点,为PCV2临床检测提供了一种新的选择。

摘要： 近年来,由椰毒假单胞菌酵米面亚种引起的食物中毒事件常有发生,其毒素米酵菌酸的致病性极强,死亡率高,引起人们的高度关注。本文主要从国标法中的微生物培养技术、基因测序技术、PCR技术(包含常规PCR和实时荧光PCR技术)、环介导等温扩增技术及微滴数字PCR技术等方面总结椰毒假单胞菌酵米面亚种的检测方法,并对该菌未来的研究方向进行展望。

摘要： 目的探讨在支气管扩张症急性加重期常见感染病原体检测中应用环介导等温扩增(LAMP)技术的价值。方法选择2021年1月-2021年12月赣南医学院第一附属医院收治的支气管扩张症患者218例。收集患者痰液,均进行痰细菌培养和LAMP技术。结果218例患者共留取合格痰标本218份,致病菌阳性者34例(15.60%);共分离出病原菌43株,其中38株革兰阴性菌,占比88.37%,5株革兰阳性菌,占比11.63%。218例患者LAMP方法扩增的产物,致病菌阳性者93例,阳性率为42.66%;共分离出病原菌153株,其中细菌119株,革兰阴性菌为100株,占比65.36%,革兰阳性菌19株,占比12.42%,其余34株为非典型病原菌,占比22.22%。以痰培养为金标准,肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、流感嗜血杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌敏感度分别为75.00%,70.00%,83.33%,66.67%,66.67%,66.67%;特异度分别为92.86%,84.62%,97.64%,85.58%,95.35%,93.02%。结论在支气管扩张症急性加重期常见感染病原体检测中应用LAMP能够特异、高效、快速明确病原菌,可为临床合理选择抗生素提供参考,具有广阔的应用前景。

摘要： 本文建立了环介导等温扩增技术(Loop.mediated isothermal amplification,LAMP)快速检测化妆品中铜绿假单胞菌的方法.采用铜绿假单胞菌外膜蛋白oprI基因保守序列引物,评价检测铜绿假单胞菌灵敏度和特异性,并与普通PCR相比,检测人工污染样品中的铜绿假单胞菌.结果显示,LAMP检测铜绿假单胞菌的灵敏度为62.5pg/μL,而且特异性高,人工污染样品中的检出限为102cfu/mL,比PCR检测灵敏度高10倍.该方法具有灵敏度高、特异性好、操作简便、耗时短,可用于化妆品中铜绿假单胞菌的快速检测.

摘要： 环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种新型的能在恒定温度条件下实现核酸序列快速扩增的技术.由于该技术快速、便捷、高效、低成本等方面的优势,目前已广泛应用于分子诊断方面.本文介绍了LAMP的技术原理、检测方法、研究进展,以及该技术在农业分子诊断与基因检测方面的应用.

摘要： 根据葵花籽HaG5特异基因序列,采用设计软件Primer Explorer Version4设计并筛选出Lamp特异性扩增引物,优化反应条件和反应体系后建立食品过敏原葵花籽的环介导等温扩增技术检测方法,同时对该方法的灵敏度、特异性以及稳定性进行验证.实验结果表明,在巴西坚果、碧根果等17中坚果中,该检测方法可准确检出葵花籽过敏原成分,灵敏度达到0.5％,特异性和稳定性达到100％.对于市售的7份预包装食品中可特异性检出葵花籽成分,与产品标签相符合.

摘要： 为了建立一种能够快速、准确、高效地检测山核桃干腐病菌的技术,本研究根据茶蔗子葡萄座腔菌的β-tubulin基因序列设计外引物、内引物和环引物,并对扩增体系和条件进行了优化、并分析其特异性和灵敏度.结果使用羟基萘酚蓝(HNB)作为反应指示剂,反应体系(Bst DNA聚合酶0.16U/μL,外引物F3和B3均为0.2μmol/L,内引物FIP和BIP均为1.6μmol/L,环引物LB为0.8μmol/L,Mg2+为4mmol/L,dNTP为1mmol/L,甜菜碱Betaine为0.6mmol/L)在等温(64°C)条件下反应1h能特异性检测山核桃干腐病菌:以山核桃干腐病菌DNA为模板的反应液呈阳性(变为蓝色),而其余的病菌均为阴性(仍为紫色),该技术的最低检测限为1pg/μL.

摘要： 环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)由Notomi T等人设计并应用于病毒检测[1].本文介绍了该技术在鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭坦布苏病毒、沙门氏菌等鸭病原微生物检测中的应用，发现该技术具有敏感性高、特异性好、视觉直观检测、对仪器要求低、价格便宜等优点,被广泛应用于多种病原微生物的检测.

摘要： 本研究利用环介导等温扩增技术,建立了进境苜蓿种质的LAMP快速鉴定方法.选取叶绿体基因组中的条码基因matK设计的一组特异性引物,进行反应条件优化,从而建立起了苜蓿种质的LAMP鉴定方法.该方法检测快速,灵敏度比PCR法高10倍,可有效区分几种同为豆科的牧草;通过观察仪器输出的实时荧光曲线即可判断是否发生了扩增,大大提高了检测速度.本研究为进境苜蓿种质鉴定提供了一种较为快速、可行的方法.

摘要： 环介导等温扩增技术(LAMP)是近年米新出现的一种核酸扩增技术,具有敏感性高、特异性好、视觉直观检测、对仪器要求低、价格便宜等优点.目前,已被广泛应用于多种病原微生物的检测.本文综述了LAMP技术在9种鸭病原微生物检测中的应用,以供鸭病原微生物的快速检测借鉴.

摘要： 本研究以郁金香基腐病菌(Fusarium oxysporum f.sp.tulipae,Fot)的核糖体转录间区(Internal transcribed spacer,ITS)DNA作为目的序列,设计特异性引物,建立并优化了郁金香基腐病菌的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)可视化检测方法.研究表明,该方法检测灵敏度达到10pg/μL;应用该方法对不同批次分离的5株郁金香基本腐病菌和5份接种发病的郁金香种球进行检测,LAMP产物均表现为阳性(绿色),对照的22株其病原菌以及5份健康郁金香种球样品经LAMP检测均表现为阴性(橙色).实验结果表明,郁金香基腐病菌LAMP可视化检测方法能够应用于实验室以及现场检疫工作中.

摘要： 本研究以郁金香基腐病菌(Fusarium oxysporum f.sp.tulipae,Fot)的核糖体转录间区(Internal transcribed spacer,ITS)DNA作为目的序列,设计特异性引物,建立并优化了郁金香基腐病菌的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)可视化检测方法.研究表明,该方法检测灵敏度达到10pg/μL;应用该方法对不同批次分离的5株郁金香基本腐病菌和5份接种发病的郁金香种球进行检测,LAMP产物均表现为阳性(绿色),对照的22株其病原菌以及5份健康郁金香种球样品经LAMP检测均表现为阴性(橙色).实验结果表明,郁金香基腐病菌LAMP可视化检测方法能够应用于实验室以及现场检疫工作中.

摘要： 本研究以郁金香基腐病菌(Fusarium oxysporum f.sp.tulipae,Fot)的核糖体转录间区(Internal transcribed spacer,ITS)DNA作为目的序列,设计特异性引物,建立并优化了郁金香基腐病菌的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)可视化检测方法.研究表明,该方法检测灵敏度达到10pg/μL;应用该方法对不同批次分离的5株郁金香基本腐病菌和5份接种发病的郁金香种球进行检测,LAMP产物均表现为阳性(绿色),对照的22株其病原菌以及5份健康郁金香种球样品经LAMP检测均表现为阴性(橙色).实验结果表明,郁金香基腐病菌LAMP可视化检测方法能够应用于实验室以及现场检疫工作中.

摘要： 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于LNA‑环介导等温扩增LAMP技术及其在女性生殖道分泌物中念珠菌的检测应用。本发明提供了一种创新型“LNA‑Loop引物”；以及核酸扩增试剂，该试剂中包括Bst聚合酶、环介导等温扩增引物/LNA‑Loop引物和扩增缓冲液;该试剂利用特异性的扩增引物及LNA‑Loop引物扩增检测五种女性生殖道常见的念珠菌，使扩增结果可实时辨别，避免了复杂传统检测手段，提高了检测的效率。并且可以实现对白色念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌的灵敏、特异、多重检测。

摘要： 本发明公开一种以肽聚糖水解酶pcsB基因为靶序列的环介导等温扩增快速检测无乳链球菌的方法，所述引物含SEQID.NO.1‑2的内引物，SEQID.NO.3‑4的外引物和SEQID.NO.5的环引物。其特征在于：1）64°C,1小时LAMP反应，通过实时浊度仪可有效检测无乳链球菌的最低基因组模板量为1 pg，灵敏度是普通PCR电泳分析和荧光PCR的100倍。2）以SYBR Green I为显色试剂，LAMP反应1‑3小时可对1 ng模板的无乳链球菌进行准确检测。

摘要： 本发明属于生物检测领域，具体涉及一种重叠环介导等温核酸扩增技术。具体技术方案包括：一种环介导等温核酸扩增技术用扩增引物，所述扩增引物为重叠引物，所述重叠引物包括正向引物F和反向引物R，正向引物F的右边为拼接DNA序列下游DNA的正常PCR引物F，左边为带有上游DNA正义连序列或者和反向引物R互补的特定序列，反向引物R左边为拼接DNA上游DNA的正常PCR引物R，右边为带有下游DNA反义序列或者和正向引物F互补的特定序列。本发明提供了一种新的LAMP引物设计及基因检测方法，首次提出了“重叠引物”的概念和设计思路，通过设计特异性的重叠引物，帮助多基因实现重叠环介导等温核酸扩增反应，引物设计方法简单、反应结果准确、反应效率高。

摘要： 本发明提供一种基于环介导等温核酸扩增技术的微生物检测试剂盒，包括：盒体，盒体内设有容置腔；放置板，水平横置于容置腔的上部；密封板，平行布置于放置板的下方，密封板的外周缘与盒体的内壁密封连接；反应区，放置板与密封板之间的空腔，用于盛装液体，反应区设置用于承接试管底部的托板，托板上设置用于记录保温时间的计时装置；测温管，垂直插装在密封板上，顶端封闭且底部开口的直管；活塞，滑动嵌设在测温管内，活塞连接向下延伸出测温管的推杆；加热装置，设置于反应区外部，用于加热并保持反应区的液体，并与推杆的底部连接。本发明具备检测、保温和计时的功能。

摘要： 本发明公开了一种环介导等温扩增技术对鳕鱼的鉴定所用引物；包括：针对大西洋鳕鱼的引物，针对太平洋鳕鱼的引物，针对黑线鳕的引物，针对鳕科鳕鱼的引物。本发明还同时提供了利用上述引物进行的环介导等温扩增技术对鳕鱼的鉴定方法，包括以下步骤：1)、待测样品(包括鱼类样品)中基因组DNA的提取；2)、利用引物进行实时荧光LAMP法和LAMP染色法；3)、根据实时荧光LAMP法和LAMP染色法检测结果进行判断。本发明将环等温扩增技术应用于国内市场常见鳕鱼(大西洋鳕鱼、太平洋鳕鱼及黑线鳕)及相关产品的品种鉴定标记研究。

摘要： 本发明公开了一种基于环介导等温扩增技术的病原菌检测方法，属于病原体检测技术领域，该检测方法具体步骤如下：(1)微流控芯片设计与制作；(2)监控整个病原菌检测过程；(3)病原菌检测结果判断；本发明通过利用相机等成像设备或肉眼等即可对结果进行观察，与LAMP进行有机结合，研发出兼顾上述两类技术优势的分子诊断技术，能够在POCT中简便、快速、灵活、高通量检测各种病原菌，为临床诊治或感染事件现场处置等情况节约时间和成本。

摘要： 本发明公开了一种基于环介导等温扩增技术检测十二种马铃薯病害病原菌的引物组合物及检测方法。本发明方法是对致病疫霉、链格孢菌、尖孢镰刀菌、木贼镰刀菌、禾谷镰刀菌、层出镰刀菌、接骨木镰刀菌、茄丝核菌、茄科雷尔氏菌、黑腐果胶杆菌、链霉菌和粉痂菌的分子检测方法。本发明方法不需要复杂仪器，能较好满足对12种马铃薯病害病原菌的现场检测，为检疫性病害病原菌的检测提供了新的技术平台，能较好满足目前对马铃薯病害的现场检测的迫切需要，用于进出口检疫、田间检疫等的现场检测，易于大范围推广应用。

摘要： 本发明创造提供了一种使用环介导等温扩增技术检测幽门螺杆菌感染的方法和试剂盒。所用引物进行了特异性和灵敏性实验，结果表明该引物特异性良好，灵敏性高，本研究用探针法Q‑PCR和LAMP两种方法进行鉴定，通过SPSS统计学软件分析，P<0.05，差异具有统计学意义，表明建立的LAMP方法可以应用于幽门螺杆菌的鉴定。

摘要： 本发明提供了一种基于多靶标环介导等温扩增技术可视化检测新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)的引物组组合及试剂盒，同时选取SARS‑CoV‑2 Orf1ab、E、N作为检测靶基因，设计3套LAMP引物组同时检测新型冠状病毒，可有效降低由于新型冠状病毒基因突变而导致假阴性。同时结合HNB染料或pH指示剂比色法肉眼观察检测RT‑LAMP扩增产物，从而开发出一种可视化检测新冠病毒(SARS‑CoV‑2)的方法，具有灵敏度高、特异性好、简单易用等优点，可基本满足现场快速、简便检测新冠病毒(SARS‑CoV‑2)的需求。

摘要： 本实用新型涉及检测芯片技术领域，且公开了一种可视化异形环介导等温扩增技术专用微流控芯片，包括基板、凸卡块、流体槽、导流管、区分标识以及插孔，所述基板截面为水滴形，且基板一侧与凸卡块固定连接，所述凸卡块设于基板一侧，且凸卡块内部开设有空腔，所述流体槽设于凸卡块内部，且流体槽为圆柱型凹槽，所述导流管设于凸卡块内部，且导流管两端与流体槽相连接，所述区分标识设于基板一侧，所述插孔设于基板一侧，该实用新型，通过基板、凸卡块、流体槽、导流管、区分标识以及插孔的相互作用，使得设备在使用时，通过将导流管设于流体槽且设为圆拱形，一定程度上避免了流体在平放加热时产生回流的情况。