牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)核蛋白基因原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化与鉴定

摘要

利用RT-PCR方法扩增出牛呼吸道合胞体病毒(BRV)核蛋白基因(N)中1 176bp的特异性片段,将目的片段定向克隆到pET-32a(+)原核表达载体,转化BL21(DE3)表达菌;经IPTG进行诱导,并探讨IPTG浓度、诱导时间对重组蛋白的影响。表达的大肠杆菌超声破碎后,沉淀物用含有1%TritonX-100的PBS溶液洗去膜碎片和膜蛋白。在尿素变性条件下,用镍柱亲和层析法纯化NP包涵体,并通过梯度透析方法进行透析复性,Western blot检测目的蛋白的反应原性。结果显示,酶切和测序成功构建阳性重组质粒,将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导后发现该重组蛋白主要以包涵体形式存在于细菌中,大小约为60 000,最佳诱导条件为0.000 8 mol/L IPTG诱导4h。通过BCA法测定镍柱纯化的N蛋白质量浓度为0.534g/L,复性后质量浓度为0.397g/L。Western blot检测表明N蛋白具有反应原性。结果表明,在大肠杆菌中成功表达并纯化出N蛋白,并通过复性获得具有反应原性的N蛋白,为N蛋白下一步的应用奠定基础。