人HVEM-Fc融合蛋白的制备及其生物学特性

摘要

为建立CHO/HVEM-Fc基因转染细胞株,使之能稳定分泌HVEM-Fc融合蛋白,采用常规PCR法分别从本单位已构建的重组载体pGEZ-Term/B7-H1-Fc和pIRES2-EGFP/HVEM上扩增人IgG1(Fc)恒定区和人HVEM胞外段编码基因,XhoⅠ和Bam HI双酶切人IgG1(Fc)恒定区及真核表达载体pIRES2-EGFP,将两种酶切的目的产物连接为pIRES2-EGFP/Fc,同时将获得的人HVEM胞外段基因片段经XhoⅠ和NheⅠ酶切后插入上述pIRES2-EGFP/Fc构建成pIRES2-EGFP/HVEM-Fc重组载体,通过脂质体转染仓鼠卵巢癌CHO细胞,培养基中添加G418长期筛选并将分泌目的蛋白的基因转染细胞株亚克隆化。流式细胞术检测HVEM-Fc融合蛋白的表达,收集含融合蛋白的基因转染细胞培养上清,Protein G亲和层析柱对其进行纯化,Western blot定性分析。MTT检测HVEM-Fc融合蛋白体外对抗人CD3单抗联合基因转染细胞L929/LIGHT刺激的T淋巴细胞增殖的影响。结果表明,基因转染细胞CHO/HVEM-Fc分泌的HVEM-Fc融合蛋白能与L929/LIGHT细胞有效结合,纯化后的蛋白经Western blot鉴定出现特异性清晰条带,并且HVEM-Fc融合蛋白对L929/LIGHT协同刺激的T细胞体外增殖具有抑制作用。